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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere la metagenomica degli ampliconi per determinare la comunità batterica dell'uva Traminette, dell'uva in fermentazione e del vino finale.

Abstract

I progressi nella tecnologia di sequenziamento e l'accesso relativamente facile all'uso di strumenti bioinformatici per profilare le strutture delle comunità microbiche hanno facilitato una migliore comprensione dei microbi coltivabili e non coltivabili nell'uva e nel vino. Durante la fermentazione industriale, i microbi, noti e sconosciuti, sono spesso responsabili dello sviluppo del prodotto e del sapore sgradevole. Pertanto, la profilazione dei batteri dall'uva al vino può consentire una facile comprensione delle dinamiche microbiche in situ . In questo studio, i batteri del mosto d'uva Traminette in fase di fermentazione e il vino finale sono stati sottoposti a estrazione di DNA che ha prodotto da 15 ng/μL a 87 ng/μL. È stato sequenziato l'amplicone 16S della regione ipervariabile della regione V4, batteri relativamente abbondanti costituiti da phyla Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota e seguiti da Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota e Acidobacteriota. Un'analisi del diagramma di Venn delle unità tassonomiche operative uniche condivise (OTU) ha rivelato che 15 phyla batterici erano comuni sia al mosto d'uva, alla fase di fermentazione che al vino finale. I phyla che non erano stati segnalati in precedenza sono stati rilevati utilizzando il sequenziamento dell'amplicone 16S, così come generi come Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae. È stata testata la variazione nell'uso di nutrienti organici nel vino e il suo impatto sui batteri; Serbatoio di Traminette R contenente Fermaid O e Traminette L stimolati con Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. La diversità alfa utilizzando il test di Kruskal-Wallis ha determinato il grado di uniformità. La diversità beta indicava un cambiamento nei batteri nella fase di fermentazione per i due trattamenti, e i batteri finali del vino sembravano simili. Lo studio ha confermato che il sequenziamento dell'amplicone 16S può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti batterici durante la produzione del vino per supportare la qualità e un migliore utilizzo dei batteri dell'uva durante la produzione del vino.

Introduzione

L'uva Traminette è caratterizzata da una produzione di vino di qualità superiore, oltre che da una resa apprezzabile e da una parziale resistenza a diverse infezioni fungine 1,2,3. La fermentazione naturale dell'uva si basa sui microrganismi associati, sull'ambiente di produzione del vino e sui recipienti di fermentazione 4,5. Spesso, molte aziende vinicole si affidano a lieviti e batteri selvatici per la fermentazione, la produzione di alcol, esteri, aroma e sviluppo del sapore6.

L'obiettivo di questo studio è quello di esaminare la composizione batterica dell'uva e monitorarne la dinamica durante la fermentazione. Tuttavia, l'uso moderno di colture starter come il Saccharomyces cerevisiae per la fermentazione primaria, dove viene prodotto l'alcol, è comune a diversi stili di vino7. Inoltre, la fermentazione secondaria, in cui l'acido malico viene decarbossilato da Oenococcus oeni ad acido lattico, migliora il profilo organolettico e gustativo del vino e riduce l'acidità del vino 8,9. Con i recenti progressi nell'uso di metodi indipendenti dalla coltura, è ora possibile determinare diversi microbi associati all'uva da vino e alle specie che vengono trasferite al mosto e partecipano alla fermentazione in tempi diversi fino al prodotto finale10.

I ruoli e le dinamiche dei batteri selvatici provenienti da diverse uve trasferite al mosto durante la fermentazione del vino sono poco conosciuti. La tassonomia di molti di questi batteri non è nemmeno nota, o le loro proprietà fenotipiche non sono caratterizzate. Questo rende la loro applicazione nella fermentazione in cocoltura ancora poco sottoutilizzata. Tuttavia, l'analisi microbiologica basata sulla coltura è stata utilizzata per determinare la popolazione batterica associata all'uva e al vino10. È ampiamente noto che la placcatura selettiva della coltura è noiosa, soggetta a contaminazione, ha una bassa riproducibilità e la produzione può essere dubbia; Mancano anche le specie batteriche le cui esigenze di crescita sono sconosciute. Studi precedenti indicano che le metodologie basate sul gene rRNA 16S, indipendenti dalla coltura, offrono un approccio più affidabile ed economico alla caratterizzazione di comunità microbiche complesse11. Ad esempio, il sequenziamento delle regioni ipervariabili del gene rRNA 16S è stato impiegato con successo per studiare i batteri nelle foglie d'uva, nelle bacche e nel vino 12,13,14. Gli studi hanno dimostrato che l'uso del metabarcoding dell'rRNA 16S o del sequenziamento metagenomico dell'intero è adatto per gli studi sul microbioma15. Stanno emergendo informazioni sul possibile legame tra la diversità batterica e le loro caratteristiche metaboliche durante la produzione del vino, che potrebbero aiutare nella determinazione delle proprietà enologiche e del terroir16.

È stata sottolineata la necessità di massimizzare i vantaggi degli strumenti metagenomici che utilizzano il sequenziamento di nuova generazione (NGS) per studiare l'ecologia microbica dell'uva e del vino16,17. Inoltre, l'uso di metodi indipendenti dalla coltura basati sul sequenziamento ad alto rendimento per profilare la diversità microbica dell'ecosistema alimentare e di fermentazione è diventato molto rilevante e prezioso per molti laboratori ed è raccomandato per l'uso industriale18,19. Fornisce un vantaggio per il rilevamento e la profilazione tassonomica delle attuali popolazioni microbiche e del contributo dei microbi ambientali, della loro abbondanza relativa e della diversità alfa e beta20. Il sequenziamento della regione variabile della regione 16S è diventato un importante gene di scelta ed è stato utilizzato durante diversi studi di ecologia microbica.

Mentre molti studi si concentrano sui funghi, in particolare sui lieviti, durante la fermentazione del vino21, questo studio ha riportato il sequenziamento dell'amplicone 16S e gli strumenti bioinformatici utilizzati per studiare i batteri durante la fermentazione dell'uva Traminette per la produzione di vino.

Protocollo

1. Produzione sperimentale di vino

  1. Ottenere l'uva Traminnette dal vino Dynamis Estate a Jonesville, nel vigneto della Carolina del Nord, diraspare e pigiare per rilasciare il mosto in due fermentatori separati a cielo aperto da 600 L e lasciare sulle bucce per circa 4 giorni con i coperchi.
  2. Punzonare i tappi una volta al giorno per mantenere la pelle bagnata e limitare la produzione di acidi volatili (VA).
    NOTA: L'idea è che molti dei precursori aromatici (monoterpeni) si trovino nelle bucce e lascino il succo a contatto con la buccia per aumentare il potenziale aromatico del vino.
  3. Dopo 4 giorni, pecare Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Questo lievito è stato selezionato in quanto è un forte fermentatore ed è associato all'esaltazione del carattere varietale del vino delle uve.
  4. In un serbatoio, Traminette R, aggiungere 20 g/hL di Fermaid O quando il grado brix è a 17,7 e 20 g/hL di Fermaid O e 12,5 g/hL di Fermaid K a 13,1 g/hL per ottenere la sicurezza della fermentazione, mentre nell'altro serbatoio Traminette L, aggiungere 40 g/hL di Stimula Sauvignon blanc quando il grado brix è a 17,1. Aggiungere anche 20 g/hL di Fermaid O quando il grado brix è a 13,4 per esaltare il carattere varietale del vino.
  5. Prelevare campioni in doppio di mosto (giorno 1), lievito aggiunto (giorno 4), mosto fermentato (giorno 15) e campioni di vino finito (giorno 30) e conservare a -20 °C prima dell'estrazione del DNA e dell'analisi metagenomica.

2. Estrazione del DNA per la metagenomica

  1. Conservare tutti i campioni duplicati ottenuti sopra su ghiaccio fino alla prima centrifugazione.
  2. Trasferire 20 mL del campione fermentato in una provetta sterile con tappo a vite da 50 mL.
  3. Aggiungere 10 mL di acqua fredda e omogeneizzare (vortex). Centrifugare per 1 minuto a 800 x g a 4 °C e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 mL.
    NOTA: Questo passaggio rimuoverà i solidi del campione.
  4. Ripetere il passaggio 2.3 due volte e raggruppare i surnatanti nella stessa provetta.
  5. Centrifugare il surnatante a 3.000 x g a 4 °C per 20 minuti per pellettare le cellule. Scartare il surnatante.
  6. Risospendere il pellet in 1 mL di PBS, trasferire in una provetta con tappo a vite da 2 mL e centrifugare a 14.000 x g per 2 min. Eseguire altri due lavaggi utilizzando PBS.
  7. A questo punto, congelare i pellet a -20°C o seguire il passaggio 2.8. È importante che tutti i campioni siano trattati allo stesso modo.
  8. Aggiungere 978 μL di tampone fosfato di sodio. Preparare il tampone fosfato di sodio, aggiungere 3,1 g di NaH2PO4· H2O e 10,9 g di Na2HPO4 (anidro) a H2O distillato per ottenere un volume di 1 L e regolare il pH a 7,4.
  9. Aggiungere 122 μL di tampone di DNA (DNA spin kit) e vortice.
  10. Lasciare riposare in frigorifero (4 °C) per 45 min-1 h. Vortex i campioni ogni 15 min. Questo passaggio può essere lasciato durante la notte (o/n) o fino a quando non si è pronti per continuare a utilizzare il kit di rotazione del DNA.
  11. Trasferire 1 mL di campione in una provetta della soluzione di lisi 1 (kit di centrifugazione del DNA) e serrare il tappo (scrivere il numero del campione sul lato della provetta e non sul tappo; i reagenti del kit rimuoveranno tutto ciò che è scritto sul tappo).
  12. Omogeneizzare il campione in un macinatore per sbattere le perle (6,5 m/s, CY: 24 x 2) per 60 s per tre volte. Se il macinino battitallone ha il dispositivo per mettere il ghiaccio, metti 50 g di ghiaccio secco sotto i tubi. In caso contrario, conservare i campioni su ghiaccio umido per 5 minuti tra una fase di omogeneizzazione e l'altra.
  13. Centrifugare le provette E della matrice lisante (kit di centrifugazione del DNA) per 1 minuto a 16800 x g (o velocità massima).
  14. Trasferire il surnatante in una microprovetta pulita. Successivamente, aggiungere 250 μL di reagente per la soluzione di precipitazione proteica (PPS) (kit di centrifugazione del DNA) e mescolare agitando la provetta a mano 10 volte.
  15. Centrifugare per 5 minuti a 16800 x g per pellettare il precipitato.
  16. Trasferire il surnatante in una provetta sterile da 15 ml. Aggiungere 1 mL di sospensione della matrice di legame (kit di spin del DNA) al surnatante.
    NOTA: Risospendere la sospensione della matrice di legame prima dell'uso fino a quando non è omogenea.
  17. Capovolgere le provette a mano per 2 minuti, quindi lasciare riposare le provette in una griglia per 3 minuti (per consentire la sedimentazione della matrice di silice).
  18. Rimuovere con cautela 1 mL di surnatante. Risospendere la matrice nel surnatante rimanente.
  19. Trasferire 600 μL della miscela in una provetta con filtro centrifugo (DNA spin kit) e centrifugare per 1 minuto a 14500 x g.
  20. Aggiungere il restante composto e centrifugare.
  21. Decantare a flusso continuo e aggiungere 500 μL di soluzione di lavaggio (kit di centrifugazione del DNA) nella provetta del filtro centrifugante e centrifugare per 1 minuto a 14500 x g (assicurarsi di aggiungere EtOH alla soluzione di lavaggio; vedere il manuale del prodotto). Decantare il flow-through e ripetere il lavaggio altre due volte (3 lavaggi in totale).
  22. Decantare il flow-through e centrifugare per altri 2 minuti a 14.500 x g per asciugare la matrice di soluzione di lavaggio residua.
  23. Rimuovere il filtro rotante e metterlo in una nuova provetta di raccolta (kit di centrifuga DNA). Asciugare all'aria il filtro centrifugo per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
  24. Riscaldare l'acqua priva di DNAsi (DNA spin kit) a 55 °C per 5 min. Aggiungere 50 μL di acqua priva di DNAsi e mescolare delicatamente la matrice sulla membrana filtrante con un puntale per pipetta per un'efficiente eluizione del DNA. Lasciare riposare i campioni a RT per 1 minuto, quindi centrifugare per 1 minuto a 14500 x g per eluire il DNA.
  25. Mettere i campioni sul ghiaccio. Caricare la miscela del campione (2 μL di campione + 2 μL di acqua + 1 μL di tampone di carico) in un gel. Misurare la concentrazione di DNA.
  26. Conservare i campioni a -20 °C.
  27. Utilizzare uno spettrofotometro per quantificare il DNA estratto.
    NOTA: Un volume di 1 μL di DNA è stato eliminato e quantificato e la qualità del DNA è stata notata con un rapporto A260/A280.

3. Elettroforesi del DNA

  1. Preparare un gel di agarosio all'1% in un tampone da 0,5 Tris/Borato/EDTA (TBE) (20 mL per un mini gel, 70-100 mL per un gel medio). Pesare l'agarosio+tampone, far bollire in microonde per sciogliere l'agarosio, ripesare e aggiungere dH2O al peso originale. Raffreddare la soluzione di agarosio a 55-60 °C e versarla nella formatrice di gel con pettine. Lasciare solidificare il gel.
  2. Aggiungere 1 μL di tampone di caricamento gel 10x al campione (10 μL) e caricarlo sul gel accanto a un marcatore di peso molecolare. Passare dal negativo (nero) al positivo (rosso) a 100-115 V (gel grande) o 90 V (mini gel) fino a quando il colorante blu non è vicino al fondo.
  3. Colorare il gel per 30 minuti in bromuro di etidio da 1 μL/mL o verde SYBR (sono necessari guanti e occhiali in nitrile), risciacquare in acqua e guardare sotto una fonte di luce ultravioletta (UV). Dai campioni duplicati, selezionare la resa più alta per l'ulteriore elaborazione.

4. Sequenziamento ad alto rendimento

  1. Amplificare la regione ipervariabile V4 del gene rRNA 16S utilizzando primer specifici 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') e 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Impostare le condizioni di reazione a catena della polimerasi (PCR) a 94 °C per 2 min, 30 cicli di 94 °C per 20 s, 58 °C per 20 s, 65 °C per 1 min e 65 °C per 10 min (estensione finale).
  2. Eseguire reazioni PCR con una miscela master PCR ad alta fedeltà (Table of Materials).
  3. Genera librerie con il kit di preparazione della libreria di DNA e quindi sequenzia utilizzando il sequenziamento a due estremità su una piattaforma di sequenziamento.
    NOTA: In questo caso, le librerie generate con il kit di preparazione della libreria del DNA NEBNext Ultra II sono state sequenziate utilizzando il sequenziamento Illumina paired-end (2 × 250 bp) sulla piattaforma novaseq6000.
  4. Seguire i passaggi di sequenziamento:
    1. Fase 1: Tagliare il DNA con un enzima, di solito con un metodo che seleziona per una dimensione generale.
      1. Aggiungere 3,5 μL di tampone di sequenziamento e 1,5 μL di miscela enzimatica a 25 μL di DNA (circa 1 μg), mescolare 10 volte con una pipetta e centrifugare rapidamente.
      2. Mettere in un termociclatore con le seguenti condizioni: preriscaldare il coperchio a 75°C, (1) 30 min per 20 °C (2) 30 min per 65 °C (3) tenere a 4°C.
    2. Passaggio 2: aggiungere gli adattatori tramite legatura
      1. Aggiungere 15 μL di miscela master di legatura, 1,25 μL di adattatore, 0,5 μL di potenziatore di legatura e 30 μL di miscela di DNA di preparazione finale con una pipetta.
      2. Incubare a 20 °C per 15 minuti in un termociclatore e quindi aggiungere 1,5 μL di enzima reagente di escissione uracil-specifico (USER) alla miscela di legatura per ottenere un totale di 48,26 μL. Incubare a 37 °C per 15 minuti.
      3. Aggiungere 43,5 μL di microsfere magnetiche al DNA di legatura dell'adattatore, mescolare 20 volte con una pipetta e incubare per 5 minuti a RT. Separare le perle con un rack magnetico, quindi incubare per 5-10 minuti e scartare il surnatante.
      4. Lavare il pellet con 100 μL di etanolo all'80%, asciugare per 30 secondi e lavare di nuovo. Eluire le perle e il pellet in 8,5 μL di Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20 a 10 mM, miscelare con una pipetta e incubare a RT per 2 min.
      5. Incubare nel rack magnetico e rimuovere 7,5 μL di DNA eluito come surnatante. Posizionare l'eluito in una nuova provetta ed eseguire una fase di PCR.
      6. Innanzitutto, aggiungere 12,5 μL di master mix, 2,5 μL di primer indice i7 e 2,5 μL di primer PCR universale/primer i5 al DNA legato-adattatore da 7,5 μL per ottenere 25 μL di miscela di reazione PCR. Utilizzare la seguente condizione PCR: preriscaldare il coperchio a 103 °C. 98 °C per 30 s, 98 °C per 10 s, 65 °C per 75 s, 65 °C per 5 min e mantenere a 4 °C dopo 10 cicli.
      7. Pulire il DNA amplificato da 25 μL. Aggiungere 22,5 μL di microsfere magnetiche e mescolare 20 volte. Incubare a RT per 5 minuti e rimuovere 50 μL del surnatante. Lavare le perline con 100 μL di etanolo all'80% e rimuovere tutto l'etanolo asciugando delicatamente le perle per 30 secondi.
      8. Risospendere le perle marrone scuro in 16 μL di acqua, mescolare 20 volte con una pipetta e posizionare nel rack magnetico per 30-60 s. Trasferire 15 μL in una nuova provetta.
      9. Determinare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro. Mescolare 90 μL di tampone + 1 μL di colorante + 2 μL di campione di DNA e leggere la concentrazione. Diluire il DNA a 2 nM, caricare 27-30 μL sulla cella di flusso e posizionarlo nel sequenziatore.
    3. Fase 3: Sequenziare gli adattatori, ibridare le librerie generate sopra alla matrice della cella di flusso modellata e catturare il DNA secondo le istruzioni del produttore. Usalo come modello per la seconda sintesi.
      1. Quindi, amplificare il secondo filamento in un cluster clonale. Linearizzare il cluster e bloccare i siti attivi. Aggiungere il primer di sequenziamento per fornire un sito per il sequenziamento per sintesi nella sequenza secondo il protocollo del produttore.
        NOTA: Chimicamente, i nucleotidi modificati si legano al filamento stampo di DNA utilizzando la complementarità naturale. Ogni nucleotide ha un tag fluorescente e un terminatore reversibile che blocca l'inclusione della base successiva. Pertanto, la presenza di un segnale fluorescente indica quale nucleotide è inserito e il terminatore viene scisso per consentire alla base successiva di legarsi.
    4. Passo 4: Amplificare il filamento a legame singolo per ottenere cluster di sequenze che vengono sequenziate in tandem per sintesi.
      NOTA: I cluster forniscono un segnale più luminoso rispetto a un singolo filamento attraverso la scansione bidirezionale e la chimica di sequenziamento a due canali. Il software di sequenziamento trasferisce automaticamente i file delle chiamate di base (*.cbcl) alla posizione della cartella di output specificata per l'analisi dei dati.

5. Bioinformatica

  1. Generare i dati della sequenza come file FASTQ. Analizza per includere le seguenti parti.
    1. Parte I:
      1. Salvate i file FASTQ ottenuti dal sequencer, fate clic per aprire un foglio di calcolo e create i file di mappatura/metadati.
      2. Aprire il sito Web di Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), caricare i file FASTQ, leggere QC, filtraggio e ritaglio in QIIME222. Depositare le sequenze grezze come archivio di lettura delle sequenze (SRA) e GenBank in NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
    2. Parte II: Andate sul sito web di Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), eseguite le letture demultiplexate paired-end, la sostituzione dei filtri e gli errori chimera, e unite usando DADA223. Utilizzare il classificatore Naive Bayes addestrato sul database OTU 99% Silva versione 132 per eseguire l'assegnazione tassonomica batterica al 97% di somiglianza24.
    3. Parte III: Apri il sito Web di MicrobiomeDB, fai clic per caricare i file e genera le curve di alfa-diversità, beta-diversità, abbondanza relativa e rarefazione OTU (https://microbiomedb.org/mbio/app).
    4. Parte IV: Aprire un foglio di calcolo e trasferire i dati per creare mappe di calore, diagrammi di Venn e dimensioni dell'effetto dell'analisi discriminante lineare (https://microbiomedb.org/mbio/app).

6. Analisi statistica

  1. Aprire QIIME222 e determinare le differenze significative nella diversità alfa tra i gruppi utilizzando lo script alpha-group-meaning. Questo eseguirà anche il test di Kruskal-Wallis.
  2. Determinare le differenze nella diversità beta tra i gruppi utilizzando PERMANOVA, incluso un test a coppie25.
  3. Ottenere le differenze significative nella struttura della comunità batterica tra i gruppi utilizzando MicrobiomeDB. Un valore p ≤0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Per prima cosa sono state determinate la quantità e la qualità del DNA estratto dal mosto d'uva, dal vino in fermentazione e dal vino finale; il valore della quantità varia da 15 a 87 ng/μL (Tabella 1).

Sequenziamento e bioinformatica
Il sequencer ad alta produttività Illumina ha generato un file FASTQ che è stato importato in Nephele e visualizzato sulla piattaforma QIIME2 26. In primo luogo, è stato utilizza...

Discussione

Il protocollo di metagenomica parte dal campionamento del mosto d'uva, e quando al mosto è stato aggiunto il lievito, il vino in fermentazione e i campioni finali di vino. Questo è stato seguito dall'estrazione del DNA duplicato che è stato estratto con successo da questi campioni. Le quantità ottenute variavano in concentrazione da 15 ng/μL a 87 ng/μL. Ciò dimostra che il protocollo di estrazione del DNA è efficace per gli studi metagenomici del vino. Sebbene la qualità del DNA in A260/A280 vari, ciò può esse...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Riconoscimenti

Si ringraziano i finanziamenti dell'Appalachian State University Research Council (URC) e della borsa di studio CAPES Print Travel che hanno sostenuto la visita della FAO all'Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brasile. Questo studio è stato finanziato in parte dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Codice Finanziario 001. ECPDM è grata per la sovvenzione CAPES Print Travel che ha sostenuto la sua visita all'Appalachian State University. ECPDM è assegnista di ricerca 2 presso il Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasile (CNPq).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose gel Promega, Madison, WI USAV3121Electrophoresis 
FastPrep DNA spinKit for soil MP Biomedicals, Solon, OH USA116560-200DNA extraction 
FastQC softwareBabraham Institute, United KingdomBioinformatics 
Fermaid OScott Laboratory, Petaluma, CA USA Fermentation 
High-Fidelity PCR Master Mix New England Biolabs, USAF630SPolymerase chain reaction for sequencing 
NEBNext UltraNew England Biolabs, USANEB #E7103DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit Illumina, San Diego, CA  USADNA sequencing 
NovaSeq Control Software (NVCS)Illumina, San Diego, CA  USADNA sequencing 
Novaseq6000 platform Illumina, San Diego, CA  USADNA sequencing 
QuiBitThermoscientific, Waltham, MA, USADNA quantification 
Quickdrop spectrophotometer Molecular device, San Jose, CA, USADNA quantification 
Sodium Phosphate Sigma Aldrich342483DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon BlancScott Laboratory, Petaluma, CA USA Fermentation 

Riferimenti

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