Profilage de la communauté bactérienne des raisins Traminette en fermentation pendant la production de vin à l’aide du séquençage d’amplicons métagénomiques

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour décrire la métagénomique des amplicons afin de déterminer la communauté bactérienne des raisins Traminette, des raisins en fermentation et du vin final.

Résumé

Les progrès de la technologie de séquençage et l’accès relativement facile à l’utilisation d’outils bioinformatiques pour profiler les structures des communautés microbiennes ont facilité une meilleure compréhension des microbes cultivables et non cultivables dans le raisin et le vin. Au cours de la fermentation industrielle, les microbes, connus et inconnus, sont souvent responsables du développement et de la mauvaise saveur des produits. Par conséquent, le profilage des bactéries du raisin au vin peut permettre de comprendre facilement la dynamique microbienne in situ . Dans cette étude, les bactéries du moût de raisin Traminette en fermentation et le vin final ont été soumis à une extraction d’ADN qui a donné 15 ng/μL à 87 ng/μL. L’amplicon 16S de la région hypervariable de la région V4 a été séquencé, des bactéries relativement abondantes constituées des phylums Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota et suivies par Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcocto et Acidobacteriota. Une analyse du diagramme de Venn des unités taxonomiques opérationnelles uniques (OTU) partagées a révélé que 15 embranchements de bactéries étaient communs au moût de raisin, à l’étape de fermentation et au vin final. Des embranchements qui n’avaient pas été signalés auparavant ont été détectés à l’aide du séquençage d’amplicon 16S, ainsi que des genres tels que Enterobacteriaceae et Lactobacillaceae. La variation de l’utilisation des nutriments organiques dans le vin et son impact sur les bactéries ont été testés ; Cuve Traminette R contenant Fermaid O et Traminette L stimulée avec Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. La diversité alpha à l’aide du test de Kruskal-Wallis a déterminé le degré de planéité. La diversité bêta indiquait un changement dans les bactéries au stade de la fermentation pour les deux traitements, et les bactéries du vin finales étaient similaires. L’étude a confirmé que le séquençage d’amplicon 16S peut être utilisé pour surveiller les changements bactériens pendant la production de vin afin de soutenir la qualité et une meilleure utilisation des bactéries du raisin pendant la production de vin.

Introduction

Le raisin Traminette se caractérise par une production de vin de qualité supérieure, en plus d’un rendement appréciable et d’une résistance partielle à plusieurs infections fongiques ^1,2,3. La fermentation naturelle du raisin repose sur les micro-organismes associés, l’environnement de production du vin et les cuves de fermentation ^4,5. Souvent, de nombreux établissements vinicoles s’appuient sur des levures sauvages et des bactéries pour la fermentation, la production d’alcool, les esters, le développement des arômes et des saveurs⁶.

L’objectif de cette étude est d’examiner la composition bactérienne des raisins et de surveiller leur dynamique pendant la fermentation. Cependant, l’utilisation moderne de ferments lactiques tels que Saccharomyces cerevisiae pour la fermentation primaire, où l’alcool est produit, est commune à différents styles de vin⁷. De plus, la fermentation secondaire, où l’acide malique est décarboxylé par Oenococcus oeni en acide lactique, améliore le profil organoleptique et gustatif du vin et réduit l’acidité du vin ^8,9. Avec les progrès récents dans l’utilisation de méthodes indépendantes de la culture, il est maintenant possible de déterminer différents microbes associés au raisin de cuve et aux espèces qui sont transférés au moût et participent à la fermentation à différents moments jusqu’au produit final¹⁰.

Les rôles et la dynamique des bactéries sauvages de différents raisins transférés au moût pendant la fermentation du vin sont mal compris. La taxonomie de bon nombre de ces bactéries n’est même pas connue, ou leurs propriétés phénotypiques ne sont pas caractérisées. Cela rend leur application en coculture encore peu utilisée. Cependant, une analyse microbiologique basée sur des cultures a été utilisée pour déterminer la population bactérienne associée au raisin et au vin¹⁰. Il est bien connu que le placage de culture sélective est fastidieux, sujet à la contamination, a une faible reproductibilité et le rendement peut être douteux ; il manque également des espèces bactériennes dont les besoins de croissance sont inconnus. Des études antérieures indiquent que les méthodologies basées sur le gène de l’ARNr 16S indépendantes de la culture offrent une approche plus fiable et plus rentable pour caractériser les communautés microbiennes complexes¹¹. Par exemple, le séquençage des régions hypervariables du gène de l’ARNr 16S a été utilisé avec succès pour étudier les bactéries dans les feuilles de vigne, les baies et le vin 12,13,14. Des études ont montré que l’utilisation du métabarcodage de l’ARNr 16S ou du séquençage métagénomique entier convient aux études du microbiome¹⁵. Des informations émergentes sur le lien possible entre la diversité bactérienne et leurs attributs métaboliques pendant la production de vin, ce qui pourrait aider à déterminer les propriétés œnologiques et le terroir¹⁶.

La nécessité de maximiser les avantages des outils métagénomiques utilisant le séquençage de nouvelle génération (NGS) pour étudier l’écologie microbienne du raisin et du vin a été soulignée^16,17. De plus, l’utilisation de méthodes indépendantes de la culture basées sur le séquençage à haut débit pour profiler la diversité microbienne de l’écosystème alimentaire et de fermentation est devenue très pertinente et précieuse pour de nombreux laboratoires et est recommandée pour un usage industriel^18,19. Il offre un avantage de détection et de profilage taxonomique des populations microbiennes actuelles et de la contribution des microbes environnementaux, de leur abondance relative et de leur diversité alpha et bêta²⁰. Le séquençage de la région variable de la région 16S est devenu un gène de choix important et a été utilisé lors de différentes études écologiques microbiennes.

Alors que de nombreuses études se concentrent sur les champignons, en particulier les levures, pendant la fermentation du vin²¹, cette étude a rapporté le séquençage d’amplicon 16S et les outils bioinformatiques utilisés pour étudier les bactéries pendant la fermentation des raisins Traminette pour la production de vin.

Protocole

1. Production de vin expérimentale

1. Obtenez des raisins Traminnette du vin Dynamis Estate à Jonesville, vignoble de Caroline du Nord, égrappez et écrasez pour libérer le moût dans deux fermenteurs ouverts séparés de 600 L et laissez sur les peaux pendant environ 4 jours avec les couvercles.
2. Défoncez les bouchons une fois par jour pour garder la peau humide et limiter la production d’acides volatils (VA).
   NOTE : L’idée est qu’une grande partie des précurseurs aromatiques (monoterpènes) sont situés dans les peaux et laissent le jus en contact avec la peau pour augmenter le potentiel aromatique du vin.
3. Au bout de 4 jours, lancer Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Cette levure a été sélectionnée car elle est un fermenteur puissant et est associée à la mise en valeur du caractère variétal du vin à partir des raisins.
4. Dans une cuve, Traminette R, ajoutez 20 g/hL de Fermaid O lorsque le brix est à 17,7 et 20 g/hL de Fermaid O et 12,5 g/hL de Fermaid K à 13,1 g/hL pour obtenir une sécurité de fermentation, tandis que dans l’autre cuve Traminette L, ajoutez 40 g/hL de Stimula Sauvignon blanc lorsque le brix est à 17,1. Ajoutez également 20 g/hL de Fermaid O lorsque le brix est à 13,4 pour renforcer le caractère variétal du vin.
5. Prélever des échantillons en double de moût (jour 1), de levure ajoutée (jour 4), de moût fermenté (jour 15) et de vin fini (jour 30) et conserver à -20 °C avant l’extraction de l’ADN et l’analyse métagénomique.

2. Extraction d’ADN pour la métagénomique

1. Conserver tous les échantillons en double obtenus ci-dessus sur de la glace jusqu’à la première centrifugation.
2. Transvaser 20 mL de l’échantillon fermenté dans un tube stérile à bouchon à vis de 50 mL.
3. Ajouter 10 mL d’eau froide et homogénéiser (vortex). Centrifuger pendant 1 min à 800 x g à 4 °C et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL.
   REMARQUE : Cette étape éliminera les solides de l’échantillon.
4. Répétez l’étape 2.3 deux fois et regroupez les surnageants dans le même tube.
5. Centrifuger le surnageant à 3 000 x g à 4 °C pendant 20 min pour granuler les cellules. Jetez le surnageant.
6. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS, transférer dans un tube à bouchon à vis de 2 mL et centrifuger à 14 000 x g pendant 2 min. Effectuez deux autres lavages à l’aide de PBS.
7. À cette étape, congelez les granulés à -20°C ou suivez l’étape 2.8. Il est important que tous les échantillons soient traités de la même manière.
8. Ajouter 978 μL de tampon de phosphate de sodium. Préparez le tampon de phosphate de sodium, ajoutez 3,1 g de NaH₂PO₄· H₂O et 10,9 g de Na₂HPO₄ (anhydre) à H₂O distillé pour obtenir un volume de 1 L et ajuster le pH à 7,4.
9. Ajouter 122 μL de tampon d’ADN (kit de spin d’ADN) et vortex.
10. Laissez reposer au réfrigérateur (4 °C) pendant 45 min-1 h. Vortex les échantillons toutes les 15 min. Cette étape peut être laissée toute la nuit (o/n) ou jusqu’à ce qu’elle soit prête à continuer à utiliser le kit de spin DNA.
11. Transférez 1 mL d’échantillon dans un tube de solution de lyse 1 (trousse de centrifugation de l’ADN) et serrez le capuchon (écrivez le numéro de l’échantillon sur le côté du tube et non sur le bouchon ; les réactifs de la trousse enlèveront tout ce qui est écrit sur le bouchon).
12. Homogénéiser l’échantillon dans un broyeur à billes (6,5 m/s, CY : 24 x 2) pendant 60 s trois fois. Si le broyeur à billes a l’appareil pour mettre de la glace, mettez 50 g de glace carbonique sous les tubes. Sinon, conserver les échantillons sur de la glace humide pendant 5 minutes entre chaque étape d’homogénéisation.
13. Tubes E de matrice de lyse centrifugeuse (kit de spin ADN) pendant 1 min à 16800 x g (ou vitesse maximale).
14. Transférez le surnageant dans un microtube propre. Par la suite, ajouter 250 μL de réactif de solution de précipitation des protéines (PPS) (kit de spin ADN) et mélanger en secouant le tube à la main 10 fois.
15. Centrifuger pendant 5 min à 16800 x g pour granuler le précipité.
16. Transférer le surnageant dans un tube stérile de 15 ml. Ajouter 1 mL de suspension de matrice de liaison (kit de spin ADN) au surnageant.
    REMARQUE : Remettre en suspension la suspension de la matrice de liaison avant utilisation jusqu’à ce qu’elle soit homogène.
17. Retournez les tubes à la main pendant 2 min, puis laissez reposer les tubes dans une grille pendant 3 min (pour permettre la décantation de la matrice de silice).
18. Retirer délicatement 1 mL de surnageant. Remettre la matrice en suspension dans le surnageant restant.
19. Transférer 600 μL du mélange dans un tube filtrant à centrifugation (kit de centrifugation DNA) et centrifuger pendant 1 min à 14500 x g.
20. Ajouter le reste du mélange et centrifuger.
21. Décanter le flux et ajouter 500 μL de solution de lavage (kit d’essorage DNA) dans le tube filtrant et centrifuger pendant 1 min à 14500 x g (assurez-vous d’ajouter de l’EtOH à la solution de lavage ; voir le manuel du produit). Décanter le passage et répéter le lavage deux fois de plus (3 lavages au total).
22. Décanter le flux et centrifuger pendant 2 minutes supplémentaires à 14 500 x g pour sécher la matrice de la solution de lavage résiduelle.
23. Retirez le filtre d’essorage et placez-le dans un tube de récupération frais (kit d’essorage DNA). Faites sécher le filtre à l’air libre pendant 5 min à température ambiante (RT).
24. Réchauffez l’eau sans DNAse (kit d’essorage DNA) à 55 °C pendant 5 min. Ajoutez 50 μL d’eau exempte d’ADN et remuez doucement la matrice sur la membrane filtrante avec une pointe de pipette pour une élution efficace de l’ADN. Laisser reposer les échantillons à RT pendant 1 min, puis centrifuger pendant 1 min à 14500 x g pour éluer l’ADN.
25. Placez les échantillons sur de la glace. Chargez le mélange d’échantillons (2 μL d’échantillon + 2 μL d’eau + 1 μL de tampon de chargement) dans un gel. Mesurez la concentration d’ADN.
26. Conservez les échantillons à -20 °C.
27. Utilisez un spectrophotomètre pour quantifier l’ADN extrait.
    REMARQUE : Un volume d’ADN de 1 μL a été déposé et quantifié, et la qualité de l’ADN a été notée à un rapport A260/A280.

3. Électrophorèse de l’ADN

1. Préparer un gel d’agarose à 1 % dans un tampon 0,5 Tris/Borate/EDTA (TBE) (20 mL pour un mini gel, 70-100 mL pour un gel moyen). Peser l’agarose + tampon, faire bouillir au micro-ondes pour faire fondre l’agarose, peser à nouveau et ajouter dH₂O au poids d’origine. Refroidir la solution d’agarose à 55-60 °C et verser dans le gélifiant avec peigne. Laissez le gel se solidifier.
2. Ajouter 1 μL de tampon de chargement de gel 10x à l’échantillon (10 μL) et charger sur le gel à côté d’un marqueur de poids moléculaire. Passez du négatif (noir) au positif (rouge) à 100-115 V (gros gel) ou 90 V (mini gel) jusqu’à ce que le colorant bleu soit près du fond.
3. Teinturer le gel pendant 30 minutes dans 1 μL/mL de bromure d’éthidium ou de SYBR vert (gants et lunettes en nitrile nécessaires), rincer à l’eau et visualiser sous une source de lumière ultraviolette (UV). Parmi les échantillons en double, sélectionnez le rendement le plus élevé pour un traitement ultérieur.

4. Séquençage à haut débit

1. Amplifier la région hypervariable V4 du gène de l’ARNr 16S à l’aide d’amorces spécifiques 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') et 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')²². Régler les conditions de réaction en chaîne par polymérase (PCR) à 94 °C pendant 2 min, 30 cycles de 94 °C pendant 20 s, 58 °C pendant 20 s, 65 °C pendant 1 min et 65 °C pendant 10 min (extension finale).
2. Réalisez des réactions PCR avec un master mix PCR haute fidélité (Table of Materials).
3. Générez des banques avec un kit de préparation de banques d’ADN, puis séquencez en utilisant le séquençage par paires sur une plateforme de séquençage.
   REMARQUE : Ici, les banques générées avec le kit de préparation de banques d’ADN NEBNext Ultra II ont été séquencées à l’aide d’un séquençage Illumina apparié (2 × 250 pb) sur la plate-forme novaseq6000.
4. Suivez les étapes de séquençage :
   1. Étape 1 : Cisaillez l’ADN avec une enzyme, généralement par une méthode qui sélectionne pour une taille générale.
      1. Ajouter 3,5 μL de tampon de séquençage et 1,5 μL de mélange enzymatique à 25 μL d’ADN (environ 1 μg), mélanger 10 fois avec une pipette et tourner rapidement.
      2. Placer dans un thermocycleur dans les conditions suivantes : préchauffer le couvercle à 75 °C, (1) 30 min pour 20 °C (2) 30 min pour 65 °C (3) maintenir à 4 °C.
   2. Étape 2 : Ajouter des adaptateurs par ligature
      1. Ajoutez 15 μL de mélange maître de ligature, 1,25 μL d’adaptateur, 0,5 μL d’activateur de ligature et 30 μL de mélange d’ADN de préparation finale avec une pipette.
      2. Incuber à 20 °C pendant 15 min dans un thermocycleur, puis ajouter 1,5 μL d’enzyme réactif d’excision spécifique à l’uracile (USER) au mélange de ligature pour obtenir un total de 48,26 μL. Incuber 37 °C pendant 15 min.
      3. Ajouter 43,5 μL de billes magnétiques à l’ADN de ligature de l’adaptateur, mélanger 20 fois avec une pipette et incuber pendant 5 min à RT. Séparer les billes avec un support magnétique, puis incuber pendant 5 à 10 minutes et jeter le surnageant.
      4. Lavez le granulé avec 100 μL d’éthanol à 80 %, séchez-le pendant 30 s et lavez-le à nouveau. Éluer les billes et les granulés dans 8,5 μL de 10 mM de Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC_{H 2}0, mélanger avec une pipette et incuber à RT pendant 2 min.
      5. Incuber dans le rack magnétique et prélever 7,5 μL d’ADN élué en tant que surnageant. Placez l’élu dans un nouveau tube et effectuez une étape de PCR.
      6. Tout d’abord, ajoutez 12,5 μL de mélange maître, 2,5 μL d’amorce d’index i7 et 2,5 μL d’amorce PCR universelle/amorce i5 à 7,5 μL d’ADN ligaturé par adaptateur pour obtenir 25 μL de mélange réactionnel PCR. Utilisez les conditions PCR suivantes : préchauffez le couvercle à 103 °C. 98 °C pendant 30 s, 98 °C pendant 10 s, 65 °C pendant 75 s, 65 °C pendant 5 min et maintenez à 4 °C après 10 cycles.
      7. Nettoyez l’ADN amplifié de 25 μL. Ajouter 22,5 μL de billes magnétiques et mélanger 20 fois. Incuber à RT pendant 5 min et retirer 50 μL de surnageant. Lavez les billes avec 100 μL d’éthanol à 80 % et retirez tout l’éthanol en séchant doucement les billes pendant 30 s.
      8. Remettre les billes brun foncé en suspension dans 16 μL d’eau, mélanger 20 fois avec une pipette et placer dans le support magnétique pendant 30 à 60 s. Transférez 15 μL dans un nouveau tube.
      9. Déterminez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre. Mélanger 90 μL de tampon + 1 μL de colorant + 2 μL d’échantillon de banque d’ADN et lire la concentration. Diluez l’ADN à 2 nM, chargez 27-30 μL dans la cellule d’écoulement et placez-le dans le séquenceur.
   3. Étape 3 : Séquencez les adaptateurs, hybridez les banques générées ci-dessus à la matrice de la cellule d’écoulement à motifs et capturez l’ADN selon les instructions du fabricant. Utilisez-le comme modèle pour la deuxième synthèse.
      1. Ensuite, amplifiez le deuxième brin en un groupe clonal. Linéarisez le cluster et bloquez les sites actifs. Ajouter une amorce de séquençage pour fournir un site de séquençage par synthèse dans la séquence selon le protocole du fabricant.
         REMARQUE : Chimiquement, les nucléotides modifiés se lient au brin matrice d’ADN en utilisant une complémentarité naturelle. Chaque nucléotide a une étiquette fluorescente et une terminaison réversible qui bloque l’inclusion de la base suivante. Par conséquent, la présence d’un signal fluorescent indique quel nucléotide est inséré et la terminaison est clivée pour que la base suivante se lie.
   4. Étape 4 : Amplifier le brin à liaison unique pour obtenir des groupes de séquences qui sont séquencées en tandem par synthèse.
      REMARQUE : Les clusters donnent un signal plus lumineux qu’un seul brin grâce à un balayage bidirectionnel et à une chimie de séquençage à deux canaux. Le logiciel de séquençage transfère automatiquement les fichiers d’appel de base (*.cbcl) vers l’emplacement spécifié du dossier de sortie pour l’analyse des données.

5. Bioinformatique

1. Générez les données de séquence sous forme de fichiers FASTQ. Analysez pour inclure les parties suivantes.
   1. Partie I :
      1. Enregistrez les fichiers FASTQ obtenus à partir du séquenceur, cliquez pour ouvrir un fichier de feuille de calcul et créez des fichiers de mappage/métadonnées.
      2. Ouvrez le site Web de Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), téléchargez les fichiers FASTQ, lisez QC, filtrage et découpage dans QIIME2²². Dépôt des séquences brutes sous forme d’archive de lecture de séquence (SRA) et de GenBank dans NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
   2. Partie II : Allez sur le site Web de Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), effectuez les lectures d’extrémités appariées démultiplexées, la substitution de filtres et les erreurs de chimère, et fusionnez à l’aide de DADA2²³. Utilisez le classificateur naïf bayésien entraîné sur la base de données Silva version 132 99% OTU pour effectuer une affectation taxonomique bactérienne à 97% de similarité²⁴.
   3. Partie III : Ouvrez le site Web de MicrobiomeDB, cliquez pour télécharger des fichiers et générer des courbes OTU alpha-diversité, bêta-diversité, abondance relative et raréfaction (https://microbiomedb.org/mbio/app).
   4. Partie IV : Ouvrez une feuille de calcul et transférez des données pour créer des cartes thermiques, des diagrammes de Venn et une taille d’effet d’analyse discriminante linéaire (https://microbiomedb.org/mbio/app).

6. Analyse statistique

1. Ouvrez QIIME2²² et déterminez les différences significatives de diversité alpha entre les groupes à l’aide du script alpha-group-significat. Celui-ci effectuera également le test de Kruskal-Wallis.
2. Déterminez les différences de diversité bêta entre les groupes à l’aide de PERMANOVA, y compris un test par paires²⁵.
3. Obtenez les différences significatives dans la structure de la communauté bactérienne entre les groupes à l’aide de MicrobiomeDB. Une valeur p ≤0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

La quantité et la qualité de l’ADN extrait du moût de raisin, du vin en fermentation et du vin final ont d’abord été déterminées ; la valeur de la quantité varie de 15 à 87 ng/μL (tableau 1).

Séquençage et bioinformatique
Le séquenceur à haut débit Illumina a généré un fichier FASTQ qui a été importé dans le Nephele et visualisé sur la plate-forme QIIME 2²⁶. Tout d’abord, le logiciel FastQ...

Discussion

Le protocole de métagénomique commence par l’échantillonnage du moût de raisin, et lorsque la levure a été ajoutée au moût, le vin en fermentation et les échantillons de vin finaux. Cela a été suivi par une extraction d’ADN dupliqué qui a été extraite avec succès de ces échantillons. Les quantités obtenues variaient en concentration de 15 ng/μL à 87 ng/μL. Cela montre que le protocole d’extraction de l’ADN est efficace pour les études métagénomiques du vin. Bien que la qualité de l’ADN c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel	Promega, Madison, WI USA	V3121	Electrophoresis
FastPrep DNA spinKit for soil	MP Biomedicals, Solon, OH USA	116560-200	DNA extraction
FastQC software	Babraham Institute, United Kingdom		Bioinformatics
Fermaid O	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation
High-Fidelity PCR Master Mix	New England Biolabs, USA	F630S	Polymerase chain reaction for sequencing
NEBNext Ultra	New England Biolabs, USA	NEB #E7103	DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
NovaSeq Control Software (NVCS)	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
Novaseq6000 platform	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
QuiBit	Thermoscientific, Waltham, MA, USA		DNA quantification
Quickdrop spectrophotometer	Molecular device, San Jose, CA, USA		DNA quantification
Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	342483	DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation