메타게놈 앰플리콘 염기서열분석(Metagenomic Amplicon Sequencing)을 사용한 와인 생산 중 발효 트라미네트 포도의 박테리아 군집 프로파일링

요약

여기에서는 트라미네트 포도, 발효 포도 및 최종 와인의 박테리아 군집을 결정하기 위한 앰플리콘 메타게놈을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

염기서열 분석 기술의 발전과 미생물 군집 구조를 프로파일링하기 위한 생물정보학 도구 사용에 대한 비교적 쉬운 접근은 포도와 와인의 배양 가능한 미생물과 배양 불가능한 미생물 모두에 대한 더 나은 이해를 촉진했습니다. 산업 발효 과정에서 알려지거나 알려지지 않은 미생물은 종종 제품 개발 및 맛 제거를 담당합니다. 따라서 포도에서 와인에 이르기까지 박테리아를 프로파일링하면 현장 미생물 역학을 쉽게 이해할 수 있습니다. 이 연구에서 트라미네트 포도의 박테리아는 발효를 거쳐야 하며, 최종 와인은 15ng/μL에서 87ng/μL를 산출하는 DNA 추출을 거쳤습니다. V4 영역의 초가변 영역의 16S 앰플리콘을 서열분석하였고, 프로테오박테리아(Proteobacteria), 악티노박테리오타(Actinobacteriota), 피르미쿠테스(Firmicutes), 박테로이도타(Bacteroidota), 푸소박테리오타(Fusobacteriota)로 구성된 비교적 풍부한 박테리아를 서열화하였고, 그 뒤를 이어 베루코마이크로바이오타(Verrucomicrobiota), 할로박테로타(Halobacterota), 데설포박테로타(Desulfobacterota), 믹소코코코타(Myxococcota) 및 애시도박테리오타(Acidobacteriota)가 뒤따랐다. 공유된 고유한 OTU(Operational Taxonomic Unit)에 대한 벤 다이어그램 분석에 따르면 15개의 박테리아 문(phyla)이 포도 머스트, 발효 단계 및 최종 와인 모두에 공통적으로 나타나는 것으로 나타났습니다. 이전에 보고되지 않았던 문(phyla)은 16S 앰플리콘 시퀀싱(amplicon sequencing)뿐만 아니라 장내세균(Enterobacteriaceae) 및 락토바실러스과(Lactobacillaceae)와 같은 속(genera)을 사용하여 검출되었습니다. 와인의 유기 영양소 사용의 변화와 박테리아에 미치는 영향을 테스트했습니다. Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O로 자극된 Fermaid O 및 Traminette L을 포함하는 Traminette R 탱크. Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 알파 다양성은 균일성의 정도를 결정했습니다. 베타 다양성은 두 가지 처리의 발효 단계에서 박테리아의 변화를 나타냈으며 최종 와인 박테리아는 비슷하게 보였습니다. 이 연구는 16S 앰플리콘 염기서열 분석을 사용하여 와인 생산 중 박테리아 변화를 모니터링하여 와인 생산 중 포도 박테리아의 품질과 더 나은 활용을 지원할 수 있음을 확인했습니다.

서문

트라미네트 포도는 우수한 품질의 와인 생산이 특징이며, 상당한 수확량과 여러 곰팡이 감염에 대한 부분적인 저항성이 있습니다 ^1,2,3. 포도의 자연 발효는 관련 미생물, 와인 생산 환경 및 발효 용기에 의존합니다 ^4,5. 종종 많은 와이너리에서는 발효, 알코올 생산, 에스테르, 향 및 풍미 개발을 위해 야생 효모와 박테리아에 의존합니다⁶.

이 연구의 목표는 포도의 박테리아 구성을 조사하고 발효 중 역학을 모니터링하는 것입니다. 알코올이 생산되는 1차 발효를 위해 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)과 같은 스타터 배양균을 현대적으로 사용하는 것은 다양한 와인 스타일에 공통적이다⁷. 또한 말산이 Oenococcus oeni에 의해 젖산으로 탈카르복실화되는 2차 발효는 와인의 관능 및 맛 프로필을 개선하고 와인의 산도를 감소시킵니다

프로토콜

1. 실험적인 와인 생산

1. 노스캐롤라이나주 존스빌 포도밭에 있는 다이나미스 에스테이트 와인에서 트라미네트 포도를 구해 줄기를 제거하고 으깬 후 두 개의 별도 600L 오픈탑 발효기에 넣어 뚜껑을 덮은 상태로 약 4일 동안 껍질에 그대로 둡니다.
2. 하루에 한 번 뚜껑을 아래로 내려 피부를 촉촉하게 유지하고 휘발성 산(VA) 생성을 제한하십시오.
   참고: 아이디어는 많은 방향족 전구체(모노테르펜)가 껍질에 위치하고 주스를 피부와 접촉시켜 와인의 방향족 잠재력을 증가시킨다는 것입니다.
3. 4일 후, 맥주효 모 균 추출물 추출물 QA23 (Lallemand)을 투여합니다. 이 효모는 강력한 발효기이며 포도에서 와인의 품종 특성을 향상시키는 것과 관련이 있기 때문에 선택되었습니다.
4. 한 탱크인 Traminette R에 Brix가 17.7일 때 20g/hL Fermaid O를 추가하고 13.1g/hL일 때 20g/hL Fermaid O와 12.5g/hL Fermaid K를 추가하여 발효 안전성을 확보하고, 다른 탱크인 Traminette L에 Brix가 17.1일 때 40g/hL Stimula Sauvignon bl....

토론

균유전체학(metagenomics)의 프로토콜은 포도 머스트(must)의 샘플링에서 시작되며, 머스트에 효모가 첨가되면 발효 와인과 최종 와인 샘플이 됩니다. 그 다음에는 이들 샘플에서 성공적으로 추출된 중복 DNA 추출이 뒤따랐습니다. 얻어진 양은 농도가 15ng/μL에서 87ng/μL까지 다양했습니다. 이는 DNA 추출 프로토콜이 와인의 메타게놈 연구에 효과적임을 보여줍니다. A260/A280에서 DNA의 품질은 다양하지만, ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel	Promega, Madison, WI USA	V3121	Electrophoresis
FastPrep DNA spinKit for soil	MP Biomedicals, Solon, OH USA	116560-200	DNA extraction
FastQC software	Babraham Institute, United Kingdom		Bioinformatics
Fermaid O	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation
High-Fidelity PCR Master Mix	New England Biolabs, USA	F630S	Polymerase chain reaction for sequencing
NEBNext Ultra	New England Biolabs, USA	NEB #E7103	DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
NovaSeq Control Software (NVCS)	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
Novaseq6000 platform	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
QuiBit	Thermoscientific, Waltham, MA, USA		DNA quantification
Quickdrop spectrophotometer	Molecular device, San Jose, CA, USA		DNA quantification
Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	342483	DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation