Perfil de la comunidad bacteriana de la fermentación de uvas Traminette durante la producción de vino mediante secuenciación de amplicones metagenómicos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para describir la metagenómica de amplicones para determinar la comunidad bacteriana de uvas Traminette, uvas fermentadas y vino final.

Resumen

Los avances en la tecnología de secuenciación y el acceso relativamente fácil al uso de herramientas bioinformáticas para perfilar las estructuras de las comunidades microbianas han facilitado una mejor comprensión de los microbios cultivables y no cultivables en las uvas y el vino. Durante la fermentación industrial, los microbios, conocidos y desconocidos, suelen ser responsables del desarrollo del producto y del sabor desagradable. Por lo tanto, el perfil de las bacterias desde la uva hasta el vino puede permitir una fácil comprensión de la dinámica microbiana in situ . En este estudio, las bacterias del mosto de uva Traminette en fermentación y el vino final se sometieron a una extracción de ADN que arrojó de 15 ng/μL a 87 ng/μL. Se secuenció el amplicón 16S de la región hipervariable de la región V4, bacterias relativamente abundantes constituidas por los filos Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota y seguidos por Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxoococcota, y Acidobacteriota. Un análisis del diagrama de Venn de las unidades taxonómicas operativas únicas (OTU) compartidas reveló que 15 filos de bacterias eran comunes tanto al mosto de uva, como a la etapa de fermentación y al vino final. Se detectaron filos que no habían sido reportados previamente utilizando la secuenciación del amplicón 16S, así como géneros como Enterobacteriaceae y Lactobacillaceae. Se probó la variación en el uso de nutrientes orgánicos en el vino y su impacto sobre las bacterias; El grado de uniformidad determinó la diversidad de Traminette R que contenía Fermaid O y Traminette L estimulada con Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. La diversidad alfa mediante la prueba de Kruskal-Wallis determinó el grado de uniformidad. La diversidad beta indicó un cambio en las bacterias en la etapa de fermentación de los dos tratamientos, y las bacterias finales del vino se vieron similares. El estudio confirmó que la secuenciación del amplicón 16S se puede utilizar para monitorear los cambios en las bacterias durante la producción de vino para respaldar la calidad y una mejor utilización de las bacterias de la uva durante la producción de vino.

Introducción

La uva Traminette se caracteriza por una producción de vino de calidad superior, además de un rendimiento apreciable y una resistencia parcial a varias infecciones fúngicas ^1,2,3. La fermentación natural de la uva depende de los microorganismos asociados, el ambiente de producción del vino y los recipientes de fermentación ^4,5. A menudo, muchas bodegas dependen de levaduras y bacterias silvestres para la fermentación, la producción de alcohol, ésteres, aromas^{y desarrollo de} sabores.

El objetivo de este estudio es examinar la composición bacteriana de las uvas y monitorizar su dinámica durante la fermentación. Sin embargo, el uso moderno de cultivos iniciadores como Saccharomyces cerevisiae para la fermentación primaria, donde se produce alcohol, es común a diferentes estilos de vino⁷. Además, la fermentación secundaria, en la que el ácido málico es descarboxilado por Oenococcus oeni a ácido láctico, mejora el perfil organoléptico y gustativo del vino y reduce la acidez del vino ^8,9. Con los recientes avances en el uso de métodos independientes del cultivo, ahora es posible determinar diferentes microbios asociados a la uva de vinificación y a las especies que se transfieren al mosto y participan en la fermentación en diferentes momentos hasta el producto final¹⁰.

Las funciones y la dinámica de las bacterias silvestres de diferentes uvas transferidas al mosto durante la fermentación del vino son poco conocidas. La taxonomía de muchas de estas bacterias ni siquiera se conoce, o sus propiedades fenotípicas no están caracterizadas. Esto hace que su aplicación en la fermentación de cocultivos siga estando poco infrautilizada. Sin embargo, el análisis basado en cultivos microbiológicos se ha utilizado para determinar la población bacteriana asociada a la uva y al vino¹⁰. Es ampliamente conocido que la siembra selectiva de cultivos es tediosa, propensa a la contaminación, tiene una baja reproducibilidad y el resultado puede ser dudoso; También pasa por alto especies bacterianas cuyos requisitos de crecimiento se desconocen. Estudios previos indican que las metodologías basadas en el gen 16S rRNA independientes del cultivo ofrecen un enfoque más fiable y rentable para caracterizar comunidades microbianas complejas¹¹. Por ejemplo, la secuenciación de las regiones hipervariables del gen 16S rRNA se ha empleado con éxito para estudiar bacterias en hojas de parra, bayas y vino 12,13,14. Los estudios han demostrado que el uso del metabarcoding de ARNr 16S o de la secuenciación metagenómica completa es adecuado para los estudios del microbioma¹⁵. Existe información emergente sobre la posible vinculación de la diversidad bacteriana con sus atributos metabólicos durante la producción de vino, lo que podría ayudar en la determinación de las propiedades enológicas y del terroir¹⁶.

Se ha enfatizado la necesidad de maximizar las ventajas de las herramientas metagenómicas que utilizan la secuenciación de nueva generación (NGS) para estudiar la ecología microbiana de la uva y el vino^16,17. Además, el uso de métodos independientes del cultivo basados en la secuenciación de alto rendimiento para perfilar la diversidad microbiana del ecosistema alimentario y de fermentación se ha vuelto muy relevante y valioso para muchos laboratorios y se recomienda para uso industrial^18,19. Proporciona una ventaja de detección y perfil taxonómico de las poblaciones microbianas actuales y la contribución de los microbios ambientales, su abundancia relativa y la diversidad alfa y beta²⁰. La secuenciación de la región variable de la región 16S se ha convertido en un importante gen de elección y se ha utilizado durante diferentes estudios ecológicos microbianos.

Si bien muchos estudios se centran en los hongos, especialmente en las levaduras, durante la fermentación del vino²¹, este estudio informó sobre la secuenciación de amplicones 16S y las herramientas bioinformáticas utilizadas para estudiar las bacterias durante la fermentación de las uvas Traminette para la producción de vino.

Protocolo

1. Producción experimental de vino

1. Obtenga uvas Traminnette del vino Dynamis Estate en el viñedo de Jonesville, Carolina del Norte, despalillee y estruelgue para liberar el mosto en dos fermentadores abiertos separados de 600 L y déjelos con las pieles durante aproximadamente 4 días con las tapas puestas.
2. Golpee las tapas una vez al día para mantener la piel húmeda y limitar la producción de ácidos volátiles (VA).
   NOTA: La idea es que muchos de los precursores aromáticos (monoterpenos) se sitúen en los hollejos y dejen el jugo en contacto con los hollejos para aumentar el potencial aromático del vino.
3. Después de 4 días, lanzamiento de Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Esta levadura fue seleccionada porque es un fermentador fuerte y se asocia con la mejora del carácter varietal en el vino de las uvas.
4. En un tanque, Traminette R, añadir 20 g/hL de Fermaid O cuando el brix esté a 17,7 y 20 g/hL de Fermaid O y 12,5 g/hL de Fermaid K a 13,1 g/hL para conseguir seguridad de fermentación, mientras que en el otro tanque de Traminette L, añadir 40 g/hL de Stimula Sauvignon blanc cuando el brix esté a 17,1. Añadir también 20 g/hL de Fermaid O cuando el brix esté en 13,4 para potenciar el carácter varietal del vino.
5. Tomar muestras duplicadas de mosto (día 1), levadura añadida (día 4), mosto fermentado (día 15) y muestras de vino terminado (día 30) y mantener a -20 °C antes de la extracción del ADN y el análisis metagenómico.

2. Extracción de ADN para metagenómica

1. Mantenga todas las muestras duplicadas obtenidas anteriormente en hielo hasta la primera centrifugación.
2. Transfiera 20 ml de la muestra fermentada a un tubo estéril con tapón de rosca de 50 ml.
3. Añadir 10 mL de agua fría y homogeneizar (vórtice). Centrifugar durante 1 min a 800 x g a 4 °C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mL.
   NOTA: Este paso eliminará los sólidos de la muestra.
4. Repita el paso 2.3 dos veces y agrupe los sobrenadantes en el mismo tubo.
5. Centrifugar sobrenadante a 3.000 x g a 4 °C durante 20 min para peletizar las células. Deseche el sobrenadante.
6. Vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de PBS, transfiéralo a un tubo con tapón de rosca de 2 ml y centrifugue a 14.000 x g durante 2 minutos. Realiza dos lavados más con PBS.
7. En este paso, congele los gránulos a -20 ° C o siga el paso 2.8. Es importante que todas las muestras sean tratadas de la misma manera.
8. Añadir 978 μL de tampón fosfato sódico. Preparar tampón fosfato de sodio, añadir 3,1 g de NaH₂PO₄· H₂O y 10,9 g de Na₂HPO₄ (anhidro) a H₂O destilado para obtener un volumen de 1 L, y ajustar el pH a 7,4.
9. Agregue 122 μL de tampón de ADN (kit de espín de ADN) y vórtice.
10. Dejar reposar en el frigorífico (4 °C) durante 45 min-1 h. Agitar las muestras cada 15 min. Este paso se puede dejar toda la noche (o/n) o hasta que esté listo para continuar usando el kit de centrifugado de ADN.
11. Transfiera 1 ml de muestra a un tubo de solución de lisis 1 (kit de centrifugado de ADN) y apriete la tapa (escriba el número de muestra en el costado del tubo y no en la tapa; los reactivos del kit eliminarán todo lo escrito en la tapa).
12. Homogeneizar la muestra en un molinillo de bolas (6,5 m/s, CY: 24 x 2) durante 60 s tres veces. Si el molinillo para batir perlas tiene el dispositivo para poner hielo, coloque 50 g de hielo seco debajo de los tubos. De lo contrario, mantenga las muestras en hielo húmedo durante 5 minutos entre cada paso de homogeneización.
13. Tubos centrífugos de matriz de lisis E (kit de centrifugado de ADN) durante 1 min a 16800 x g (o velocidad máxima).
14. Transfiera el sobrenadante a un microtubo limpio. A continuación, agregue 250 μL de reactivo de solución de precipitación de proteínas (PPS) (kit de centrifugado de ADN) y mezcle agitando el tubo a mano 10 veces.
15. Centrifugar durante 5 min a 16800 x g para granular el precipitado.
16. Transfiera el sobrenadante a un tubo estéril de 15 ml. Agregue 1 mL de suspensión de matriz de unión (kit de centrifugado de ADN) al sobrenadante.
    NOTA: Vuelva a suspender la suspensión de la matriz de unión antes de usarla hasta que sea homogénea.
17. Invierta los tubos a mano durante 2 minutos, luego deje reposar los tubos en una rejilla durante 3 minutos (para permitir la sedimentación de la matriz de sílice).
18. Retire con cuidado 1 ml del sobrenadante. Vuelva a suspender la matriz en el sobrenadante restante.
19. Transfiera 600 μL de la mezcla a un tubo de filtro de centrifugación (kit de centrifugación de ADN) y centrifugue durante 1 min a 14500 x g.
20. Agregue la mezcla restante y centrifugue.
21. Decantar el flujo y añadir 500 μL de solución de lavado (kit de centrifugado de ADN) en el tubo del filtro de centrifugado y centrifugar durante 1 min a 14500 x g (asegúrese de añadir EtOH a la solución de lavado; consulte el manual del producto). Decantar el flujo y repetir el lavado dos veces más (3 lavados en total).
22. Decantar el flujo continuo y centrifugar durante 2 minutos adicionales a 14.500 x g para secar la matriz de la solución de lavado residual.
23. Retire el filtro de centrifugado y colóquelo en un tubo de captura nuevo (kit de centrifugado de ADN). Secar al aire el filtro giratorio durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
24. Calentar el agua libre de ADNasa (kit de centrifugado de ADN) a 55 °C durante 5 min. Añadir 50 μL de agua libre de ADNasa y agitar suavemente la matriz sobre la membrana del filtro con una punta de pipeta para una elución eficiente del ADN. Deje reposar las muestras en RT durante 1 minuto, luego centrifugue durante 1 minuto a 14500 x g para eluir el ADN.
25. Coloque las muestras en hielo. Cargue la mezcla de muestra (2 μL de muestra + 2 μL de agua + 1 μL de tampón de carga) en un gel. Mide la concentración de ADN.
26. Almacenar las muestras a -20 °C.
27. Utilice un espectrofotómetro para cuantificar el ADN extraído.
    NOTA: Se descartó y cuantificó un volumen de 1 μL de ADN, y se observó la calidad del ADN en una relación A260/A280.

3. Electroforesis de ADN

1. Prepare gel de agarosa al 1% en tampón 0,5 Tris/Borato/EDTA (TBE) (20 ml para un mini gel, 70-100 ml para un gel mediano). Pesar agarosa + tampón, hervir en el microondas para derretir la agarosa, volver a pesar y agregar dH₂O al peso original. Enfriar la solución de agarosa a 55-60 °C y verter en el formador de gel con el conjunto de peine. Deja que el gel se solidifique.
2. Agregue 1 μL de tampón de carga de gel 10x a la muestra (10 μL) y cárguelo en el gel junto a un marcador de peso molecular. Pasa de negativo (negro) a positivo (rojo) a 100-115 V (gel grande) o 90 V (mini gel) hasta que el tinte azul esté cerca de la parte inferior.
3. Tiñe el gel durante 30 minutos en bromuro de etidio de 1 μL/ml o verde SYBR (se necesitan guantes y gafas de nitrilo), enjuague con agua y visualice bajo una fuente de luz ultravioleta (UV). De las muestras duplicadas, seleccione el rendimiento más alto para su posterior procesamiento.

4. Secuenciación de alto rendimiento

1. Amplificar la región hipervariable V4 del gen 16S rRNA utilizando los cebadores específicos 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') y 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')²². Ajuste las condiciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a 94 °C durante 2 minutos, 30 ciclos de 94 °C durante 20 s, 58 °C durante 20 s, 65 °C durante 1 min y 65 °C durante 10 min (extensión final).
2. Llevar a cabo reacciones de PCR con una mezcla maestra de PCR de alta fidelidad (Tabla de Materiales).
3. Genere bibliotecas con el kit de preparación de bibliotecas de ADN y, a continuación, secuenciar mediante secuenciación de extremos emparejados en una plataforma de secuenciación.
   NOTA: Aquí, las bibliotecas generadas con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II se secuenciaron utilizando secuenciación Illumina de extremo emparejado (2 × 250 pb) en la plataforma novaseq6000.
4. Siga los pasos de secuenciación:
   1. Paso 1: Cortar el ADN con una enzima, generalmente mediante un método que selecciona un tamaño general.
      1. Añadir 3,5 μL de tampón de secuenciación y 1,5 μL de mezcla de enzimas a 25 μL de ADN (aprox. 1 μg), mezclar 10 veces con una pipeta y centrifugar rápidamente.
      2. Colocar en un termociclador con las siguientes condiciones: precalentar la tapa a 75 °C, (1) 30 min a 20 °C (2) 30 min a 65 °C (3) mantener a 4 °C.
   2. Paso 2: Añadir adaptadores a través de la ligadura
      1. Agregue 15 μL de mezcla maestra de ligadura, 1,25 μL de adaptador, 0,5 μL de potenciador de ligadura y 30 μL de mezcla de ADN de preparación final con una pipeta.
      2. Incubar a 20 °C durante 15 min en un termociclador y luego añadir 1,5 μL de enzima reactivo de escisión específico de uracilo (USER) a la mezcla de ligadura para obtener un total de 48,26 μL. Incubar a 37 °C durante 15 min.
      3. Añadir 43,5 μL de perlas magnéticas al adaptador de ADN de ligadura, mezclar 20 veces con una pipeta e incubar durante 5 min a RT. Separar las perlas con una rejilla magnética, luego incubar durante 5-10 min, y desechar el sobrenadante.
      4. Lavar el pellet con 100 μL de etanol al 80%, secar durante 30 s y volver a lavar. Eluir las perlas y los gránulos en 8,5 μL de 10 mM de Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H₂0, mezclar con una pipeta e incubar a RT durante 2 min.
      5. Incubar en la rejilla magnética y extraer 7,5 μL de ADN eluido como sobrenadante. Coloque el eluto en un tubo nuevo y realice un paso de PCR.
      6. En primer lugar, agregue 12,5 μL de mezcla maestra, 2,5 μL de cebador índice i7 y 2,5 μL de cebador de PCR universal/cebador i5 a 7,5 μL de ADN ligado al adaptador para obtener 25 μL de mezcla de reacción de PCR. Utilice la siguiente condición de PCR: precaliente la tapa a 103 °C. 98 °C durante 30 s, 98 °C durante 10 s, 65 °C durante 75 s, 65 °C durante 5 min y manténgala a 4 °C después de 10 ciclos.
      7. Limpie el ADN amplificado de 25 μL. Añadir 22,5 μL de perlas magnéticas y mezclar 20 veces. Incubar a RT durante 5 min y eliminar 50 μL del sobrenadante. Lave las perlas con 100 μL de etanol al 80% y elimine todo el etanol secándolas suavemente durante 30 s.
      8. Vuelva a suspender las perlas de color marrón oscuro en 16 μL de agua, mezcle 20 veces con una pipeta y colóquelas en la rejilla magnética durante 30-60 s. Transfiera 15 μL a un tubo nuevo.
      9. Determine la concentración de ADN con un fluorómetro. Mezcle 90 μL de tampón + 1 μL de colorante + 2 μL de muestra de biblioteca de ADN y lea la concentración. Diluir el ADN a 2 nM, cargar 27-30 μL en la celda de flujo y colocarlo en el secuenciador.
   3. Paso 3: Secuenciar los adaptadores, hibridar las bibliotecas generadas anteriormente con la matriz de la celda de flujo con patrón y capturar el ADN según las instrucciones del fabricante. Utilízalo como plantilla para la segunda síntesis.
      1. A continuación, amplifica la segunda hebra en un grupo clonal. Linealice el clúster y bloquee los sitios activos. Agregue cebador de secuenciación para proporcionar un sitio para la secuenciación por síntesis en la secuencia según el protocolo del fabricante.
         NOTA: Químicamente, los nucleótidos modificados se unen a la hebra molde de ADN utilizando la complementariedad natural. Cada nucleótido tiene una etiqueta fluorescente y un terminador reversible que bloquea la inclusión de la siguiente base. Por lo tanto, la presencia de una señal fluorescente indica qué nucleótido se inserta, y el terminador se escinde para que la siguiente base se una.
   4. Paso 4: Amplifique la hebra unida para obtener grupos de secuencias que se secuencian en tándem por síntesis.
      NOTA: Los clústeres proporcionan una señal más brillante que una sola hebra a través del escaneo bidireccional y la química de secuenciación de dos canales. El software de secuenciación transfiere automáticamente los archivos de llamada base (*.cbcl) a la ubicación de la carpeta de salida especificada para el análisis de datos.

5. Bioinformática

1. Genere los datos de secuencia como archivos FASTQ. Analice para incluir las siguientes partes.
   1. Parte I:
      1. Guarde los archivos FASTQ obtenidos del secuenciador, haga clic para abrir un archivo de hoja de cálculo y cree archivos de asignación/metadatos.
      2. Abra el sitio web de Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), cargue los archivos FASTQ, lea Control de calidad, filtrado y recorte en QIIME2²². Deposite las secuencias sin procesar como archivo de lectura de secuencias (SRA) y GenBank en NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
   2. Parte II: Vaya al sitio web de Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), realice las lecturas de extremos emparejados demultiplexados, la sustitución de filtros y los errores de quimera, y fusione usando DADA2²³. Utilice el clasificador Bayes Naive entrenado en la base de datos Silva versión 132 99% OTU para realizar la asignación taxonómica bacteriana con una similitud del 97%²⁴.
   3. Parte III: Abra el sitio web de MicrobiomeDB, haga clic para cargar archivos y genere las curvas de diversidad alfa, beta, abundancia relativa y rarefacción (https://microbiomedb.org/mbio/app) de OTU.
   4. Parte IV: Abra una hoja de cálculo y transfiera datos para hacer mapas de calor, diagramas de Venn y tamaño del efecto de análisis discriminante lineal (https://microbiomedb.org/mbio/app).

6. Análisis estadístico

1. Abra QIIME2²² y determine las diferencias significativas en la diversidad alfa entre los grupos utilizando el script de significación del grupo alfa. Esto también realizará la prueba de Kruskal-Wallis.
2. Determinar las diferencias en la diversidad beta entre los grupos mediante el uso de PERMANOVA, incluyendo una prueba por pares²⁵.
3. Obtener las diferencias significativas en la estructura de la comunidad bacteriana entre los grupos que utilizan MicrobiomeDB. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p ≤0,05.

Resultados

Primero se determinó la cantidad y calidad del ADN extraído del mosto de uva, del vino fermentado y del vino final; el valor de la cantidad oscila entre 15 y 87 ng/μL (Tabla 1).

Secuenciación y bioinformática
El secuenciador de alto rendimiento de Illumina generó un archivo FASTQ que se importó a Nephele y se vio en la plataforma QIIME 2²⁶. En primer lugar, se utilizó el software FastQC para comprobar la cali...

Discusión

El protocolo de metagenómica parte de la toma de muestras del mosto de uva, y cuando se añade levadura al mosto, la fermentación del vino y las muestras de vino final. A esto le siguió la extracción de ADN duplicado que se extrajo con éxito de estas muestras. Las cantidades obtenidas variaron en concentración desde 15 ng/μL hasta 87 ng/μL. Esto demuestra que el protocolo de extracción de ADN es eficaz para los estudios metagenómicos del vino. Aunque la calidad del ADN en A260/A280 varía, esto puede atribuirse...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel	Promega, Madison, WI USA	V3121	Electrophoresis
FastPrep DNA spinKit for soil	MP Biomedicals, Solon, OH USA	116560-200	DNA extraction
FastQC software	Babraham Institute, United Kingdom		Bioinformatics
Fermaid O	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation
High-Fidelity PCR Master Mix	New England Biolabs, USA	F630S	Polymerase chain reaction for sequencing
NEBNext Ultra	New England Biolabs, USA	NEB #E7103	DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
NovaSeq Control Software (NVCS)	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
Novaseq6000 platform	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
QuiBit	Thermoscientific, Waltham, MA, USA		DNA quantification
Quickdrop spectrophotometer	Molecular device, San Jose, CA, USA		DNA quantification
Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	342483	DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation