激光捕获显微切割从口腔粘膜下纤维化样本中分离具有形态学和空间信息的细胞

摘要

口腔粘膜下纤维化组织的激光捕获显微切割允许从感兴趣的组织学区域精确提取细胞，以分析具有形态学和空间信息的多组学数据。

摘要

口腔粘膜下纤维化 （OSF） 是口腔中一种常见的潜在恶性疾病。上皮萎缩以及固有层和粘膜下层的纤维化经常在组织病理学载玻片上发现。上皮发育不良、上皮萎缩和衰老成纤维细胞被认为与 OSF 的恶性转化有关。然而，由于潜在恶性口腔疾病和口腔鳞状细胞癌的异质性，很难确定OSF中恶性转化的具体分子机制。在这里，我们提出了一种通过在福尔马林固定石蜡包埋的组织载玻片上进行激光捕获显微切割来获得少量携带形态学数据和空间信息的上皮或间充质细胞的方法。使用显微镜，我们可以精确捕获微尺度（~500 个细胞）发育不良或萎缩的上皮组织和纤维化上皮下组织。提取的细胞可以通过基因组或转录组测序进行评估，以获取具有形态学和空间学信息的基因组和转录组数据。这种方法消除了大量OSF组织测序的异质性和非病变区域细胞引起的干扰，从而可以对OSF组织进行精确的空间组学分析。

引言

口腔粘膜下纤维化 （OSF） 是一种慢性隐匿性疾病，主要发生在颊粘膜，导致张口受限¹。虽然 OSF 是一种多因素疾病，但槟榔或咀嚼槟榔是 OSF^{的主要原因 2,3}。由于这种地理上特定的习性，OSF主要集中在东南亚和南亚的人群中³。OSF 的常见组织学特征包括口腔黏膜上皮下方结缔组织中胶原蛋白异常沉积、血管狭窄和闭塞¹。OSF上皮组织可表现为萎缩或增生，甚至在口腔白斑时出现异型增生^4,5。

OSF 被世界卫生组织定义为一种常见的口腔潜在恶性疾病 （OPMD），具有进展为口腔鳞状细胞癌的潜力，恶性转化率为 4%-6%6,7,8,9。OSF恶性转化的机制是复杂的¹⁰。上皮细胞的异常生长，包括发育不良和萎缩，增....

研究方案

本研究经北京大学附属学校机构评审委员会批准。已获得患者的知情同意。本研究中使用的组织样本被去标识化。研究方案如图 1所示。

1. 样品制备

1. 在切片机上将福尔马林固定石蜡包埋的口腔粘膜下纤维化组织切成3μm和10μm厚度的连续切片。
2. 在水中展开各部分，然后捞到载玻片上。将3μM和10μm切片分别固定在粘附显微镜载玻片（载玻片A）和PEN膜载玻片（载玻片B）上。
3. 将载玻片放在60°C的热板上2小时。

2.苏木精-伊红染色

1. 将载玻片A和B置于二甲苯（注意）中10分钟，并重复此步骤三次。
2. 在分级乙醇溶液中以100%，100%，90%，80%和70%的顺序将A和B水合物载玻片1分钟。
3. 将载玻片 A 和 B 置于超纯蒸馏水中 30 秒
4. 将载玻片A和B置于Harris苏木精染料溶液中90秒。
5. 将载玻片A和B置于超纯蒸馏水中30秒，并重复此步骤三次。
6. 将载玻片A和B置于二苏木精溶液（注意）中2秒。
7. 将载玻片A和B置于超纯蒸馏水中30秒，并重复此步骤三次。
8. 将载玻片置于 A 和 B 中....

讨论

该协议报告了一个管道，用于捕获具有形态和空间信息的OSF组织样本，以便通过激光显微切割进行进一步的空间组学分析。从代表性结果中，我们在各种形态相关样品中鉴定出不同的CNA模式。

OSF 是 OPMD 的一种，是口腔鳞状细胞癌⁶ 的常见癌前病变。据报道，基因组不稳定性与 OPMD^17,18 的发展和恶性转化有关。多项?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion microscope slides	CITOTEST	REF.188105
Div-haematoxylin	YiLi	20230326
Eosin solution	BASO	BA4098
Ethanol	PEKING REAGENT	No.32061
Harris hematoxylin dye solution	YiLi	20230326
Hot plate	LEICA	HI1220
Laser capture microdissection system	LEICA	LMD7	Machine
Laser microdissection microsystem	LEICA	8.2.3.7603	Software
Micromount mounting medium	LEICA	REF.3801731
Microscope cover glass	CITOTEST	REF.10212450C
Microtome	LEICA	RM2235
PCR tubes	AXYGEN	16421959
PEN-membrane slides	LEICA	No.11505158
Re-blue solution	YiLi	20230326
Ultrapure distilled water	Invitrogen	REF.10977-015
Xylene	PEKING REAGENT	No.33535