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요약

구강 점막하 섬유증 조직의 레이저 캡처 미세해부를 통해 형태학적 및 공간 정보가 포함된 다중 오믹스 데이터를 분석하기 위해 조직학적 관심 영역에서 세포를 정밀하게 추출할 수 있습니다.

초록

구강 점막하 섬유증(OSF)은 구강 내 악성 질환의 흔한 유형입니다. 상피의 위축과 lamina propria와 submucosa의 섬유화는 종종 조직 병리학적 슬라이드에서 발견됩니다. 상피 이형성증, 상피 위축 및 노화 섬유아세포는 OSF의 악성 변형과 관련이 있는 것으로 제안되었습니다. 그러나 악성종양 가능성이 있는 구강질환과 구강편평세포암의 이질성으로 인해 OSF에서 악성형질전환의 특정 분자 기전을 규명하는 것은 어려운 실정이다. 여기에서는 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 슬라이드에서 레이저 캡처 미세해부를 통해 형태학적 데이터 및 공간 정보를 전달하는 소수의 상피 또는 중간엽 세포를 얻는 방법을 제시합니다. 현미경을 사용하여 미세(~500개 세포) 이형성 또는 위축성 상피 조직과 섬유성 상피하 조직을 정밀하게 캡처할 수 있습니다. 추출된 세포는 게놈 또는 전사체 염기서열 분석으로 평가하여 형태학적 및 공간 정보가 포함된 게놈 및 전사체 데이터를 획득할 수 있습니다. 이 접근법은 벌크 OSF 조직 염기서열 분석의 이질성과 병변이 없는 영역의 세포에 의해 발생하는 간섭을 제거하여 OSF 조직의 정확한 공간 오믹스 분석을 가능하게 합니다.

서문

구강 점막하 섬유증(Oral submucous fibrosis, OSF)은 주로 협측 점막에서 발생하여 입 벌림이 제한되는 만성 잠복성 질환이다1. OSF는 다인자성 질병이지만, 아레카 너트 또는 빈랑 씹는 것이 OSF 2,3의 주요 원인입니다. 이러한 지리적인 특성으로 인해 OSF는 주로 동남아시아와 남아시아의 인구에 집중되어 있다3. OSF의 일반적인 조직학적 특징으로는 구강 점막 상피 아래 결합 조직의 비정상적인 콜라겐 침착, 혈관 협착증 및 폐색이 있다1. OSF 상피 조직은 구강 백반증과 병행될 경우 위축 또는 증식증 및 이형성증의 징후를 나타낼 수 있습니다 4,5.

OSF는 세계보건기구(WHO)에 의해 4%-6%의 악성 변형률로 구강 편평 세포 암종으로 진행될 가능성이 있는 일반적인 구강 잠재적 악성 질환(OPMD)으로 정의됩니다6,7,8,9. OSF의 악성 변형의 기저에 있는 메커니즘은 복잡합니다10. 이형성증과 위축을 포함한 상피의 비정상적인 성장은 발암 가능성을 증가시키며, 기질의 노화 섬유아세포는 활성산소종(ROS) 및 기타 분자를 통해 상피-중간엽 전이(EMT)를 유도하여 OSF의 악성 진행에 관여할 수 있다10.

공간-오믹 분석 기술은 암 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 형태학적 및 공간 정보가 포함된 다중 오믹 데이터를 생성했습니다11,12,13. 여기에서는 레이저 미세해부를 통해 포르말린 고정 파라핀이 포매된 OSF 조직에서 형태학 관련 세포 집단을 캡처하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 샘플의 다중 오믹 분석은 조직 내 이질성 문제를 극복하고 OSF14의 분자 병리학 및 악성 형질전환 메커니즘에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 북경대학교 학교 및 병원의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 환자들로부터 정보에 입각한 동의를 얻었다. 이 연구에 사용된 조직 샘플은 비식별화되었습니다. 연구 계획은 그림 1에 나와 있습니다.

1. 샘플 준비

  1. 포르말린 고정 파라핀이 포함된 구강 점막하 섬유증 조직을 마이크로톰에서 3μm 및 10μm 두께의 연속 절편으로 자릅니다.
  2. 물속에서 섹션을 펼친 다음 미끄럼틀 위로 낚시를 나갑니다. 접착 현미경 슬라이드(슬라이드 A)와 PEN 멤브레인 슬라이드(슬라이드 B)에 각각 3μM 및 10μm 섹션을 고정합니다.
  3. 슬라이드를 60°C의 열판에 2시간 동안 놓습니다.

2. 헤마톡실린-에오신 염색

  1. 슬라이드 A와 B를 크실렌(주의)에 10분 동안 놓고 이 단계를 세 번 반복합니다.
  2. 등급이 매겨진 에탄올 용액에 각 농도에서 1분 동안 100%, 100%, 90%, 80% 및 70%의 순서로 슬라이드 A와 B를 수화합니다.
  3. 슬라이드 A와 B를 초순수 증류수에 30초 동안 넣습니다.
  4. 슬라이드 A와 B를 Harris hematoxylin 염료 용액에 90초 동안 놓습니다.
  5. 슬라이드 A와 B를 초순수 증류수에 30초 동안 넣고 이 단계를 세 번 반복합니다.
  6. 슬라이드 A와 B를 div-hematoxylin 용액(주의)에 2초 동안 넣습니다.
  7. 슬라이드 A와 B를 초순수 증류수에 30초 동안 넣고 이 단계를 세 번 반복합니다.
  8. 슬라이드를 A와 B에 1% re-blue 용액에 2초 동안 넣습니다.
  9. 슬라이드 A와 B를 초순수 증류수에 30초 동안 넣고 이 단계를 세 번 반복합니다.
  10. 슬라이드를 에오신 용액에 2초 동안 놓습니다.
  11. 슬라이드 A와 B를 초순수 증류수에 30초 동안 넣고 이 단계를 세 번 반복합니다.
  12. 등급이 매겨진 에탄올 용액에서 슬라이드를 70, 80%, 90%, 100% 및 100%의 순서로 각 농도에서 2초 동안 탈수합니다.
  13. 슬라이드 A를 자일렌에 3분 동안 넣고 이 단계를 두 번 반복합니다.
  14. 장착 매체(CAUTION)를 한 방울 떨어뜨려 A를 밀고 덮개 유리로 덮습니다.

3. 조직학적 형태 관찰 및 레이저 포획 현미해부

  1. 레이저 미세해부 시스템 및 소프트웨어를 시작합니다(그림 2).
  2. 슬라이드 A를 슬라이드 스테이지에 놓고 조직학적 형태를 관찰하여 레이저 미세 해부의 관심 영역을 식별합니다.
  3. 슬라이드 A를 제거하고 슬라이드 B를 슬라이드 스테이지에 거꾸로 놓습니다.
  4. Unload(언로드) 단추(그림 2)를 클릭하여 수집 장치를 밀어냅니다. 중합효소연쇄반응(PCR) 튜브를 수집 장치에 삽입하고 튜브가 고정되어 있는지 확인합니다. 확인 단추를 클릭합니다(그림 3).
  5. Collector Device: Tube Caps를 표시한 해당 빨간색 원을 클릭하여 캡을 선택합니다. 선택한 원이 녹색으로 바뀝니다.
  6. 그리기 버튼과 그리기 + 잘라내기 버튼을 클릭하고 마우스를 사용하여 관심 영역을 스케치합니다.
  7. 클릭 자르기 시작 버튼을 눌러 관심 영역을 캡처합니다. 캡처된 샘플은 캡에 의해 수집됩니다(그림 4).
  8. 아래쪽 버튼을 클릭하여 캡처된 샘플이 수집되었는지 확인합니다(그림 5).
  9. Specimen 버튼을 클릭하여 다음 샘플을 캡처합니다.
  10. Unload 버튼을 클릭하여 캡처된 샘플이 있는 PCR 튜브를 언로드합니다.

결과

OSF 조직의 레이저 미세해부를 수행하여 이형성 상피, 이형성 상피 아래의 기질, 위축성 상피 및 위축성 상피 조직 아래의 기질 샘플을 캡처했습니다(그림 1). DNA 추출과 저심도 전체 게놈 염기서열 분석을 통해 형태학 관련 복제 수 변경(CNA)을 분석할 수 있었습니다15. CNA는 OPMD15,16에서 악성 형질전환의 위험 증가?...

토론

이 프로토콜은 레이저 미세해부를 통한 추가 공간 오믹 분석을 위해 형태학적 및 공간 정보가 포함된 OSF 조직 샘플을 캡처하는 파이프라인을 보고했습니다. 대표 결과에서 다양한 형태학 관련 샘플에서 서로 다른 CNA 패턴을 확인했습니다.

OPMD의 일종인 OSF는 구강 편평 세포 암종의 흔한 전암성 상태이다6. 게놈 불안정성은 OPMD17,18

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81671006, 81300894), CAMS 의학 혁신 기금 (2019-I2M-5-038), 국가 임상 핵심 분야 구축 프로젝트 (PKUSSNKP-202102), 베이징 대학 건강 과학 센터 우수 박사 후보자 혁신 기금 (BMU2022BSS001)의 연구 보조금으로 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesion microscope slidesCITOTESTREF.188105
Div-haematoxylinYiLi20230326
Eosin solutionBASOBA4098
EthanolPEKING REAGENTNo.32061
Harris hematoxylin dye solutionYiLi20230326
Hot plateLEICAHI1220
Laser capture microdissection systemLEICALMD7Machine
Laser microdissection microsystemLEICA8.2.3.7603Software
Micromount mounting mediumLEICAREF.3801731
Microscope cover glassCITOTESTREF.10212450C
MicrotomeLEICARM2235
PCR tubesAXYGEN16421959
PEN-membrane slidesLEICANo.11505158
Re-blue solutionYiLi20230326
Ultrapure distilled waterInvitrogenREF.10977-015
XylenePEKING REAGENTNo.33535

참고문헌

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