Выделение клеток с морфологической и пространственной информацией из образцов субмукозного фиброза полости рта методом лазерной микродиссекции

Резюме

Лазерная микродиссекция субмукозных фиброзных тканей полости рта позволяет точно извлекать клетки из интересующих гистологических областей для анализа мультиомиксных данных с морфологической и пространственной информацией.

Аннотация

Субмукозный фиброз полости рта (ОСФ) является распространенным типом потенциально злокачественного заболевания полости рта. Атрофия эпителия и фиброз собственной пластинки и подслизистой оболочки часто обнаруживаются на гистопатологических предметных стеклах. Было высказано предположение, что дисплазия эпителия, атрофия эпителия и стареющие фибробласты связаны со злокачественной трансформацией OSF. Однако из-за гетерогенности потенциально злокачественных заболеваний полости рта и плоскоклеточного рака полости рта трудно выявить специфические молекулярные механизмы злокачественной трансформации при ОСФ. В данной работе представлен метод получения небольшого количества эпителиальных или мезенхимальных клеток, несущих морфологические данные и пространственную информацию, методом микродиссекции с лазерным захватом на фиксированных формалином предметных стеклах, залитых парафином. С помощью микроскопа мы можем точно захватить микромасштабную (~500 клеток) диспластическую или атрофическую эпителиальную ткань и фиброзную субэпителиальную ткань. Извлеченные клетки могут быть оценены с помощью секвенирования генома или транскриптома для получения геномных и транскриптомных данных с морфологической и пространственной информацией. Этот подход устраняет гетерогенность массового секвенирования тканей OSF и интерференцию, вызванную клетками в непораженных областях, что позволяет проводить точный пространственно-омиксный анализ тканей OSF.

Введение

Субмукозный фиброз полости рта (ОСФ) – это хроническое коварное заболевание, которое развивается преимущественно в слизистой оболочке щек и приводит к ограничению открывания рта¹. В то время как OSF является многофакторным заболеванием, жевание ореха ареки или ореха бетеля является основной причиной OSF ^2,3. Из-за этой географически специфической привычки OSF преимущественно концентрируется в популяциях в Юго-Восточной и Южной Азии³. Общие гистологические признаки OSF включают аномальное отложение коллагена в соединительной ткани под эпителием слизистой оболочки полости рта, стеноз сосудов и окклюзию¹. Эпителиальная ткань OSF может проявляться атрофией или гиперплазией и даже дисплазией при одновременном применении с лейкоплакией полости рта ^4,5.

OSF определяется Всемирной организацией здравоохранения как распространенное оральное потенциально злокачественное заболевание (OPMD), которое демонстрирует потенциал прогрессирования до плоскоклеточного рака полости рта со скоростью злокачественной трансформации 4%-^6%6,7,8,9. Механизм, лежащий в основе злокачественной трансформации OSF, сложен¹⁰. Аномальный рост эпителия, включающий как дисплазию, так и атрофию, увеличивает потенциал канцерогенеза, а стареющие фибробласты в строме могут быть вовлечены в злокачественную прогрессию OSF путем индуцирования эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) через активные формы кислорода (АФК) и другие молекулы¹⁰.

Технологии пространственно-омического анализа позволили получить мультиомные данные с морфологической и пространственной информацией, которые позволили получить представление о механизмах развития рака^11,12,13. Здесь мы представляем протокол для захвата морфологических клеточных популяций из фиксированной формалином парафиносодержащей ткани OSF методом лазерной микродиссекции. Мультиомный анализ этих образцов может преодолеть проблемы, связанные с внутритканевой гетерогенностью, и улучшить понимание молекулярной патологии и механизмов злокачественной трансформации в OSF¹⁴.

протокол

Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом школы и больницы Пекинского университета. От пациентов было получено информированное согласие. Образцы тканей, использованные в этом исследовании, были обезличены. Схема исследования показана на рисунке 1.

1. Пробоподготовка

1. Разрезать на микротоме ткани ротовой полости с парафином, залитые парафином, на непрерывные участки толщиной 3 мкм и 10 мкм.
2. Разложите секции в воде, а затем выловите рыбу на горках. Зафиксируйте участки 3 мкМ и 10 мкм на предметных стеклах адгезионного микроскопа (слайд А) и PEN-мембранных предметных стеклах (слайд Б) соответственно.
3. Поместите предметные стекла на плиту при температуре 60 °C на 2 часа.

2. Окрашивание гематоксилин-эозином

1. Поместите слайды А и Б в ксилол (ОСТОРОЖНО) на 10 минут и повторите этот шаг трижды.
2. Гидратируйте предметные стекла А и В в градуированных растворах этанола порядка 100%, 100%, 90%, 80% и 70% в течение 1 мин в каждой концентрации.
3. Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с
4. Поместите предметные стекла А и Б в раствор красителя гематоксилина Харриса на 90 с.
5. Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
6. Поместите слайды А и Б в раствор див-гематоксилина (ОСТОРОЖНО) на 2 с.
7. Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
8. Поместите предметные стекла в А и Б в 1%-ный раствор повторного синения на 2 с.
9. Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
10. Поместите предметные стекла в раствор эозина на 2 с.
11. Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
12. Обезвоживают предметные стекла в градуированных растворах этанола порядка 70%, 80%, 90%, 100% и 100% в течение 2 с в каждой концентрации.
13. Поместите предметное стекло А в ксилол на 3 минуты и повторите этот шаг дважды.
14. Добавьте каплю монтажного носителя (ОСТОРОЖНО) на слайд A и накройте его покровным стеклом.

3. Наблюдение за гистологической морфологией и микродиссекция с помощью лазерного захвата

1. Запустите систему лазерной микродиссекции и программное обеспечение (рис. 2).
2. Поместите предметное стекло А на предметное стекло и понаблюдайте за гистологической морфологией, чтобы определить область интереса для лазерной микродиссекции.
3. Снимите слайд А и поместите слайд Б обратно на предметный столик.
4. Нажмите кнопку «Выгрузить » (рис. 2), чтобы вытолкнуть устройство сбора. Вставьте пробирку для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в устройство для сбора и убедитесь, что пробирка зафиксирована. Нажмите кнопку OK (рисунок 3).
5. Выберите колпачок, щелкнув по соответствующему красному кружку, обозначающему устройство сбора: Крышки для трубок. Выбранный круг станет зеленым.
6. Нажмите кнопки Рисовать и Рисовать + Вырезать и используйте мышь, чтобы нарисовать интересующую область.
7. Нажмите кнопку «Начать вырезание », чтобы захватить интересующую область; захваченный образец будет собран колпачком (рис. 4).
8. Нажмите кнопку Lower , чтобы убедиться в том, что захваченный образец собран (рис. 5).
9. Нажмите кнопку Образец , чтобы получить следующий образец.
10. Нажмите кнопку «Выгрузить», чтобы выгрузить пробирку для ПЦР с захваченным образцом.

Результаты

Выполняя лазерную микродиссекцию тканей OSF, мы получили образцы диспластического эпителия, стромы под диспластическим эпителием, атрофического эпителия и стромы под атрофической эпителиальной тканью (рис. 1). Благодаря выделению ДНК и низкоглубинному секвенированию в?...

Обсуждение

В этом протоколе сообщалось о конвейере для захвата образцов тканей OSF с морфологической и пространственной информацией для дальнейшего пространственно-омического анализа с помощью лазерной микродиссекции. Исходя из репрезентативных результатов, мы идентифицировали различные патт?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion microscope slides	CITOTEST	REF.188105
Div-haematoxylin	YiLi	20230326
Eosin solution	BASO	BA4098
Ethanol	PEKING REAGENT	No.32061
Harris hematoxylin dye solution	YiLi	20230326
Hot plate	LEICA	HI1220
Laser capture microdissection system	LEICA	LMD7	Machine
Laser microdissection microsystem	LEICA	8.2.3.7603	Software
Micromount mounting medium	LEICA	REF.3801731
Microscope cover glass	CITOTEST	REF.10212450C
Microtome	LEICA	RM2235
PCR tubes	AXYGEN	16421959
PEN-membrane slides	LEICA	No.11505158
Re-blue solution	YiLi	20230326
Ultrapure distilled water	Invitrogen	REF.10977-015
Xylene	PEKING REAGENT	No.33535