Isolamento de Células com Informações Morfológicas e Espaciais de Amostras de Fibrose Submucosa Oral por Microdissecção por Captura a Laser

Resumo

A microdissecção por captura a laser de tecidos de fibrose submucosa oral permite a extração precisa de células de regiões histológicas de interesse para a análise de dados multi-ômicos com informações morfológicas e espaciais.

Resumo

A fibrose submucosa oral (FSO) é um tipo comum de doença potencialmente maligna na cavidade oral. A atrofia do epitélio e a fibrose da lâmina própria e da submucosa são frequentemente encontradas nas lâminas histopatológicas. Displasia epitelial, atrofia epitelial e fibroblastos senescentes têm sido propostos como associados à transformação maligna da FSO. No entanto, devido à heterogeneidade de doenças orais potencialmente malignas e carcinoma epidermóide oral, é difícil identificar os mecanismos moleculares específicos de transformação maligna em FSO. Apresentamos um método para obter um pequeno número de células epiteliais ou mesenquimais carregando dados morfológicos e informações espaciais por microdissecção por captura a laser em lâminas de tecido fixadas em formalina e emblocadas em parafina. Usando um microscópio, podemos capturar precisamente em microescala (~500 células) tecido epitelial displásico ou atrófico e tecido subepitelial fibrótico. As células extraídas podem ser avaliadas por sequenciamento genômico ou transcriptoma para aquisição de dados genômicos e transcriptômicos com informações morfológicas e espaciais. Essa abordagem elimina a heterogeneidade do sequenciamento tecidual de OSF em massa e a interferência causada por células em áreas não lesionadas, permitindo uma análise espacial-ômica precisa do tecido OSF.

Introdução

A fibrose submucosa oral (FSO) é uma doença crônica e insidiosa que se desenvolve principalmente na mucosa bucal e resulta em restrição da abertura^bucal1. Enquanto a FSO é uma doença multifatorial, a mastigação da noz de areca ou noz de betel é a principal causa de FSO ^2,3. Devido a esse hábito geograficamente específico, a FSO está predominantemente concentrada em populações do Sudeste e Sul da Ásia³. As características histológicas comuns da FSO incluem deposição anormal de colágeno no tecido conjuntivo abaixo do epitélio da mucosa oral, estenose vascular e oclusão¹. O tecido epitelial da FSO pode apresentar manifestações de atrofia ou hiperplasia e até displasia quando concomitante à leucoplasia^oral4,5.

A FSO é definida pela Organização Mundial da Saúde como uma doença oral comum potencialmente maligna (DMOP) que apresenta potencial para evoluir para carcinoma epidermóide oral com taxa de transformação maligna de 4%-6%6,7,8,9. O mecanismo subjacente à transformação maligna da FSO é complexo¹⁰. O crescimento anormal do epitélio, incluindo tanto displasia quanto atrofia, aumenta o potencial de carcinogênese, e fibroblastos senescentes no estroma podem estar envolvidos na progressão maligna da FSO por induzir a transição epitélio-mesenquimal (TEM) através de espécies reativas de oxigênio (EROs) e outras moléculas¹⁰.

Tecnologias para análises espaço-ômicas geraram dados multi-ômicos com informações morfológicas e espaciais que forneceram informações sobre os mecanismos do câncer^11,12,13. Aqui, apresentamos um protocolo para capturar populações celulares relacionadas à morfologia de tecido OSF fixado em formalina e embebido em parafina por microdissecção a laser. Análises multi-ômicas dessas amostras podem superar desafios com heterogeneidade intratecidual e aumentar a compreensão da patologia molecular e dos mecanismos de transformação maligna em FSO¹⁴.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Escola e Hospital da Universidade de Pequim. Os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. As amostras de tecido utilizadas neste estudo foram desidentificadas. O esquema do estudo é mostrado na Figura 1.

1. Preparação da amostra

1. Corte tecidos de fibrose oral submucosa fixados em formalina e fixados em parafina em cortes contínuos de 3 μm e 10 μm de espessura em micrótomo.
2. Desdobre as seções na água e, em seguida, pesque nos escorregadores. Fixar os cortes de 3 μM e 10 μm nas lâminas do microscópio de adesão (lâmina A) e PEN-membrana (lâmina B), respectivamente.
3. Coloque as lâminas numa placa quente a 60 °C durante 2 horas.

2. Coloração hematoxilina-eosina

1. Coloque as lâminas A e B em xileno (CUIDADO) por 10 min e repita esta etapa três vezes.
2. Hidratar as lâminas A e B em soluções graduadas de etanol da ordem de 100%, 100%, 90%, 80% e 70% por 1 min em cada concentração.
3. Coloque as corrediças A e B em água destilada ultrapura por 30 s
4. Colocar as lâminas A e B em solução corante de hematoxilina Harris por 90 s.
5. Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
6. Coloque as lâminas A e B em solução de div-hematoxilina (CUIDADO) por 2 s.
7. Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
8. Coloque as lâminas em A e B em solução reazul a 1% por 2 s.
9. Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
10. Coloque as lâminas em solução de eosina por 2 s.
11. Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
12. Desidratar as lâminas em soluções graduadas de etanol da ordem de 70%, 80%, 90%, 100% e 100% por 2 s em cada concentração.
13. Coloque o slide A em xileno por 3 min e repita este passo duas vezes.
14. Adicione uma gota de meio de montagem (CUIDADO) ao slide A e cubra com um vidro de cobertura.

3. Observação da morfologia histológica e microdissecção por captura a laser

1. Iniciar o sistema de microdissecção a laser e o software (Figura 2).
2. Coloque a lâmina A no palco da lâmina e observe a morfologia histológica para identificar a área de interesse para microdissecção a laser.
3. Remova o slide A e coloque o slide B inversamente no palco do slide.
4. Clique no botão Unload (Figura 2) para enviar o dispositivo de coleta. Insira um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) no dispositivo de coleta e certifique-se de que o tubo seja mantido fixo. Clique no botão OK (Figura 3).
5. Selecione uma tampa clicando no círculo vermelho correspondente marcando o Dispositivo coletor: tampas de tubo. O círculo selecionado ficará verde.
6. Clique no botão Desenhar e no botão Desenhar + Recortar e use o mouse para esboçar a área de interesse.
7. Clique no botão Iniciar Recorte para capturar a área de interesse; a amostra capturada será coletada pela tampa (Figura 4).
8. Clique no botão Inferior para garantir que a amostra capturada seja coletada (Figura 5).
9. Clique no botão Amostra para capturar a próxima amostra.
10. Clique no botão Descarregar para descarregar o tubo de PCR com a amostra capturada.

Resultados

Através da microdissecção a laser dos tecidos da OSF, foram capturadas amostras de epitélio displásico, estroma abaixo do epitélio displásico, epitélio atrófico e estroma abaixo do tecido epitelial atrófico (Figura 1). Através da extração de DNA e sequenciamento do genoma completo em baixa profundidade, pudemos analisar as alterações no número de cópias relacionadas à morfologia (CNA)¹⁵. O CNA é uma forma comum de instabilidade genômica associada a...

Discussão

Este protocolo relatou um pipeline para capturar amostras de tecido OSF com informações morfológicas e espaciais para análises espaço-ômicas adicionais através de microdissecção a laser. A partir dos resultados representativos, identificamos diferentes padrões de CNA entre várias amostras relacionadas à morfologia.

OSF, um tipo de DMOP, é uma condição pré-cancerosa comum do carcinoma epidermóide oral6^. A instabilidade genômica tem sido relatada como as...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion microscope slides	CITOTEST	REF.188105
Div-haematoxylin	YiLi	20230326
Eosin solution	BASO	BA4098
Ethanol	PEKING REAGENT	No.32061
Harris hematoxylin dye solution	YiLi	20230326
Hot plate	LEICA	HI1220
Laser capture microdissection system	LEICA	LMD7	Machine
Laser microdissection microsystem	LEICA	8.2.3.7603	Software
Micromount mounting medium	LEICA	REF.3801731
Microscope cover glass	CITOTEST	REF.10212450C
Microtome	LEICA	RM2235
PCR tubes	AXYGEN	16421959
PEN-membrane slides	LEICA	No.11505158
Re-blue solution	YiLi	20230326
Ultrapure distilled water	Invitrogen	REF.10977-015
Xylene	PEKING REAGENT	No.33535