בידוד תאים עם מידע מורפולוגי ומרחבי מדגימות פיברוזיס תת-רירית דרך הפה באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר

Summary

לכידת לייזר microdissection של רקמות פיברוזיס submucous הפה מאפשר מיצוי מדויק של תאים מאזורים היסטולוגיים של עניין לניתוח של נתונים multi-omics עם מידע מורפולוגי ומרחבי.

Abstract

פיברוזיס תת-רירית אוראלית (OSF) היא סוג נפוץ של הפרעה שעלולה להיות ממאירה בחלל הפה. ניוון אפיתל ופיברוזיס של lamina propria ואת submucosa נמצאים לעתים קרובות על שקופיות היסטופתולוגיות. דיספלסיה אפיתליאלית, ניוון אפיתל ופיברובלסטים מזדקנים הוצעו כקשורים לשינוי ממאיר של OSF. עם זאת, בגלל ההטרוגניות של הפרעות אוראליות שעלולות להיות ממאירות וקרצינומה של תאי קשקש אוראליים, קשה לזהות את המנגנונים המולקולריים הספציפיים של טרנספורמציה ממאירה ב- OSF. כאן, אנו מציגים שיטה להשגת מספר קטן של תאים אפיתליאליים או מזנכימליים הנושאים נתונים מורפולוגיים ומידע מרחבי על ידי לכידת לייזר microdissection על שקופיות רקמה משובצות פרפין קבוע פורמלין. באמצעות מיקרוסקופ, אנו יכולים ללכוד במדויק מיקרוסקאלה (~ 500 תאים) רקמת אפיתל דיספלסטית או אטרופית ורקמה תת-אפיתל פיברוטית. ניתן להעריך את התאים שחולצו על ידי ריצוף גנום או שעתוק כדי להשיג נתונים גנומיים ושעתוק עם מידע מורפולוגי ומרחבי. גישה זו מסירה את ההטרוגניות של ריצוף רקמות OSF בתפזורת ואת ההפרעה הנגרמת על ידי תאים באזורים שאינם נגועים, ומאפשרת ניתוח מרחבי מדויק של רקמת OSF.

Introduction

פיברוזיס תת-רירית אוראלית (OSF) היא מחלה כרונית וחתרנית המתפתחת בעיקר ברירית הבוקאלית וגורמת לפתיחת פה מוגבלת¹. בעוד OSF היא מחלה multifactorial, אגוז ארקה או אגוז betel לעיסה היא הגורם העיקרי של OSF ^2,3. בגלל הרגל גיאוגרפי ספציפי זה, OSF מרוכז בעיקר באוכלוסיות בדרום מזרח ודרום אסיה³. המאפיינים ההיסטולוגיים הנפוצים של OSF כוללים שקיעת קולגן חריגה ברקמת החיבור מתחת לאפיתל רירית הפה, היצרות כלי הדם וחסימה¹. רקמת אפיתל OSF יכולה להציג עם ביטויים של ניוון או hyperplasia ואפילו דיספלסיה כאשר במקביל leukoplakia אוראלי ^4,5.

OSF מוגדר על ידי ארגון הבריאות העולמי כהפרעה פומית פוטנציאלית ממאירה נפוצה (OPMD) המציגה את הפוטנציאל להתקדם לקרצינומה של תאי קשקש אוראליים עם שיעור טרנספורמציה ממאירה של 4%-6%6,7,8,9. המנגנון העומד בבסיס הטרנספורמציה הממאירה של OSF הוא מורכב¹⁰. גדילה חריגה של האפיתל, כולל דיספלזיה וניוון, מגבירה את הפוטנציאל לקרצינוגנזה, ופיברובלסטים מזדקנים בסטרומה עשויים להיות מעורבים בהתקדמות הממאירה של OSF על ידי גרימת מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) דרך מיני חמצן תגובתי (ROS) ומולקולות אחרות¹⁰.

טכנולוגיות לניתוחים מרחביים-אומיים הפיקו נתונים רב-אומיים עם מידע מורפולוגי ומרחבי שסיפקו תובנות לגבי מנגנוני סרטן^11,12,13. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללכידת אוכלוסיות תאים הקשורות למורפולוגיה מרקמת OSF משובצת פרפין קבועה פורמלין על ידי מיקרודיסקציה בלייזר. ניתוחים רב-אומיים של דגימות אלה יכולים להתגבר על אתגרים עם הטרוגניות תוך רקמתית ולהגביר את ההבנה של הפתולוגיה המולקולרית והמנגנונים של טרנספורמציה ממאירה ב- OSF¹⁴.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של בית הספר ובית החולים של אוניברסיטת פקין. התקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים. דגימות הרקמה ששימשו במחקר זה לא זוהו. סכמת המחקר מוצגת באיור 1.

1. הכנת מדגם

1. חתכו רקמות פיברוזיס תת-ריריות אוראליות משובצות פרפין קבועות פורמלין למקטעים רציפים בעובי 3 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר על מיקרוטום.
2. פרשו את המקטעים במים ואז דגו החוצה אל המגלשות. תקן את המקטעים של 3 מיקרומטר ו- 10 מיקרומטר בשקופיות מיקרוסקופ הדבקה (שקופית A) ושקופיות קרום PEN (שקופית B), בהתאמה.
3. הניחו את המגלשות על פלטה חמה בטמפרטורה של 60°C למשך שעתיים.

2. צביעת Hematoxylin-eosin

1. מקם שקופיות A ו- B בקסילן (זהירות) למשך 10 דקות וחזור על שלב זה שלוש פעמים.
2. לחות שקופיות A ו- B בתמיסות אתנול מדורגות בסדר גודל של 100%, 100%, 90%, 80% ו- 70% למשך דקה אחת בכל ריכוז.
3. הניחו מגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות
4. מניחים שקופיות A ו- B בתמיסת צבע המטוקסילין של האריס למשך 90 שניות.
5. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
6. מקם שקופיות A ו- B בתמיסת div-hematoxylin (זהירות) למשך 2 שניות.
7. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
8. מקם שקופיות ב- A ו- B בתמיסת 1% כחול מחדש למשך 2 שניות.
9. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
10. מניחים שקופיות בתמיסת eosin למשך 2 שניות.
11. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
12. יש לייבש את השקופיות בתמיסות אתנול מדורגות בסדר גודל של 70%, 80%, 90%, 100% ו-100% עבור 2 שניות בכל ריכוז.
13. הניחו את שקופית A בקסילן למשך 3 דקות וחזרו על שלב זה פעמיים.
14. הוסף טיפה של אמצעי הרכבה (זהירות) כדי להחליק A ולכסות אותו בזכוכית כיסוי.

3. תצפית על מורפולוגיה היסטולוגית ומיקרודיסקציה לכידת לייזר

1. הפעל את מערכת המיקרודיסקציה של הלייזר ואת התוכנה (איור 2).
2. מקם את שקופית A על במת השקופיות והתבונן במורפולוגיה ההיסטולוגית כדי לזהות את אזור העניין למיקרודיסקציה בלייזר.
3. הסר את שקופית א' ומקם את שקופית ב' הפוך על במת השקופים.
4. לחצו על הלחצן Unload (איור 2) כדי לדחוף החוצה את התקן האיסוף. הכנס צינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) להתקן האיסוף וודא שהצינור מוחזק קבוע. לחצו על הלחצן OK (איור 3).
5. בחר מכסה על-ידי לחיצה על העיגול האדום המתאים המסמן את התקן האספן: מכסי צינורות. העיגול שנבחר יהפוך לירוק.
6. לחץ על לחצן צייר וצייר + גזור כפתור והשתמש בעכבר כדי לשרטט את תחום העניין.
7. לחץ על התחל גזירה כפתור כדי ללכוד את אזור העניין; הדגימה שתילכד תיאסף על-ידי הכובע (איור 4).
8. לחץ על הלחצן התחתון כדי לוודא שהדגימה שנלכדה נאספת (איור 5).
9. לחץ על לחצן הדגימה כדי ללכוד את הדגימה הבאה.
10. לחץ על Unload כפתור לפריקת צינור ה- PCR עם הדגימה שנתפסה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

על-ידי ביצוע מיקרודיסקציה בלייזר של רקמות OSF, לכדנו דגימות של אפיתל דיספלסטי, סטרומה מתחת לאפיתל דיספלסטי, אפיתל אטרופי וסטרומה מתחת לרקמת אפיתל אטרופית (איור 1). באמצעות חילוץ דנ"א וריצוף גנום שלם בעומק נמוך, הצלחנו לנתח שינויים הקשורים למורפולוגיה של מספרי העתקים (CNA)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה דיווח על צינור ללכידת דגימות רקמת OSF עם מידע מורפולוגי ומרחבי לניתוחים מרחביים-אומיים נוספים באמצעות מיקרודיסקציה בלייזר. מהתוצאות המייצגות, זיהינו דפוסי CNA שונים בקרב דגימות שונות הקשורות למורפולוגיה.

OSF, סוג של OPMD, הוא מצב טרום סרטני נפוץ של קרצינומה של תאי קשק...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion microscope slides	CITOTEST	REF.188105
Div-haematoxylin	YiLi	20230326
Eosin solution	BASO	BA4098
Ethanol	PEKING REAGENT	No.32061
Harris hematoxylin dye solution	YiLi	20230326
Hot plate	LEICA	HI1220
Laser capture microdissection system	LEICA	LMD7	Machine
Laser microdissection microsystem	LEICA	8.2.3.7603	Software
Micromount mounting medium	LEICA	REF.3801731
Microscope cover glass	CITOTEST	REF.10212450C
Microtome	LEICA	RM2235
PCR tubes	AXYGEN	16421959
PEN-membrane slides	LEICA	No.11505158
Re-blue solution	YiLi	20230326
Ultrapure distilled water	Invitrogen	REF.10977-015
Xylene	PEKING REAGENT	No.33535