Isolement de cellules avec des informations morphologiques et spatiales à partir d’échantillons de fibrose sous-muqueuse buccale par microdissection par capture laser

Résumé

La microdissection par capture laser des tissus de fibrose sous-muqueuse buccale permet d’extraire avec précision des cellules des régions histologiques d’intérêt pour l’analyse de données multi-omiques avec des informations morphologiques et spatiales.

Résumé

La fibrose sous-muqueuse buccale (OSF) est un type courant de trouble potentiellement malin dans la cavité buccale. L’atrophie de l’épithélium et la fibrose de la lamina propria et de la sous-muqueuse sont souvent retrouvées sur les lames histopathologiques. Il a été proposé que la dysplasie épithéliale, l’atrophie épithéliale et les fibroblastes sénescents soient associés à la transformation maligne de l’OSF. Cependant, en raison de l’hétérogénéité des maladies buccales potentiellement malignes et du carcinome épidermoïde buccal, il est difficile d’identifier les mécanismes moléculaires spécifiques de la transformation maligne dans l’OSF. Nous présentons ici une méthode permettant d’obtenir un petit nombre de cellules épithéliales ou mésenchymateuses portant des données morphologiques et des informations spatiales par microdissection à capture laser sur des lames de tissus enrobés de paraffine fixées au formol. À l’aide d’un microscope, nous pouvons capturer avec précision le tissu épithélial dysplasique ou atrophique à l’échelle microscopique (~500 cellules) et le tissu sous-épithélial fibrotique. Les cellules extraites peuvent être évaluées par séquençage du génome ou du transcriptome afin d’acquérir des données génomiques et transcriptomiques avec des informations morphologiques et spatiales. Cette approche élimine l’hétérogénéité du séquençage tissulaire OSF en vrac et l’interférence causée par les cellules dans les zones non lésionnelées, ce qui permet une analyse spatio-omique précise des tissus OSF.

Introduction

La fibrose sous-muqueuse buccale (OSF) est une maladie chronique et insidieuse qui se développe principalement dans la muqueuse buccale et entraîne une ouverture de la bouche restreinte¹. Alors que l’OSF est une maladie multifactorielle, la mastication de la noix d’arec ou de la noix de bétel est la principale cause d’OSF ^2,3. En raison de cette habitude géographiquement spécifique, l’OSF est principalement concentrée dans les populations d’Asie du Sud-Est et d’Asie du Sud³. Les caractéristiques histologiques communes de l’OSF comprennent un dépôt anormal de collagène dans le tissu conjonctif sous l’épithélium de la muqueuse buccale, une sténose vasculaire et une occlusion¹. Le tissu épithélial OSF peut présenter des manifestations d’atrophie ou d’hyperplasie et même de dysplasie lorsqu’il est concomitant avec une leucoplasie buccale ^4,5.

L’OSF est définie par l’Organisation mondiale de la santé comme une maladie buccale potentiellement maligne (MPPO) courante qui présente le potentiel d’évoluer vers un carcinome épidermoïde de la bouche avec un taux de transformation maligne de 4 % à 6 %^6,7,8,9. Le mécanisme sous-jacent à la transformation maligne de l’OSF est complexe¹⁰. Une croissance anormale de l’épithélium, y compris la dysplasie et l’atrophie, augmente le potentiel de cancérogenèse, et les fibroblastes sénescents du stroma peuvent être impliqués dans la progression maligne de l’OSF en induisant une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) par l’intermédiaire d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et d’autres molécules¹⁰.

Les technologies d’analyse spatio-omique ont généré des données multi-omiques avec des informations morphologiques et spatiales qui ont permis de mieux comprendre les mécanismes du cancer^11,12,13. Ici, nous présentons un protocole pour capturer des populations cellulaires liées à la morphologie à partir de tissus OSF fixés au formol et enrobés de paraffine par microdissection laser. Les analyses multi-omiques de ces échantillons peuvent surmonter les défis liés à l’hétérogénéité intratissulaire et améliorer la compréhension de la pathologie moléculaire et des mécanismes de la transformation maligne dans l’OSF¹⁴.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’école et de l’hôpital de l’Université de Pékin. Le consentement éclairé des patients a été obtenu. Les échantillons de tissus utilisés dans cette étude ont été anonymisés. Le schéma d’étude est illustré à la figure 1.

1. Préparation de l’échantillon

1. Couper des tissus de fibrose sous-muqueuse buccale enrobés de paraffine fixés au formol en sections continues de 3 μm et 10 μm d’épaisseur sur un microtome.
2. Dépliez les sections dans l’eau, puis pêchez sur les toboggans. Fixez les sections de 3 μM et 10 μm sur les lames de microscope à adhérence (diapositive A) et les lames à membrane PEN (diapositive B), respectivement.
3. Placez les lames sur une plaque chauffante à 60 °C pendant 2 h.

2. Coloration à l’hématoxyline-éosine

1. Placer les lames A et B dans du xylène (ATTENTION) pendant 10 min et répéter cette étape trois fois.
2. Hydrater les lames A et B dans des solutions d’éthanol graduées de l’ordre de 100 %, 100 %, 90 %, 80 % et 70 % pendant 1 min à chaque concentration.
3. Placer les lames A et B dans de l’eau distillée ultra-pure pendant 30 s
4. Placer les lames A et B dans la solution de colorant à l’hématoxyline Harris pendant 90 s.
5. Placez les lames A et B dans de l’eau distillée ultra-pure pendant 30 s et répétez cette étape trois fois.
6. Placer les lames A et B dans une solution de div-hématoxyline (ATTENTION) pendant 2 s.
7. Placez les lames A et B dans de l’eau distillée ultra-pure pendant 30 s et répétez cette étape trois fois.
8. Placer les lames dans A et B dans une solution rebleue à 1 % pendant 2 s.
9. Placez les lames A et B dans de l’eau distillée ultra-pure pendant 30 s et répétez cette étape trois fois.
10. Placer les lames dans une solution d’éosine pendant 2 s.
11. Placez les lames A et B dans de l’eau distillée ultra-pure pendant 30 s et répétez cette étape trois fois.
12. Déshydrater les lames dans des solutions d’éthanol graduées de l’ordre de 70 %, 80 %, 90 %, 100 % et 100 % pendant 2 s à chaque concentration.
13. Placez la lame A dans le xylène pendant 3 min et répétez cette étape deux fois.
14. Ajoutez une goutte de support de montage (ATTENTION) sur la glissière A et couvrez-la d’une vitre de protection.

3. Observation de la morphologie histologique et microdissection par capture laser

1. Lancez le système et le logiciel de microdissection laser (Figure 2).
2. Placez la lame A sur la platine de la lame et observez la morphologie histologique pour identifier la zone d’intérêt pour la microdissection laser.
3. Retirez la diapositive A et placez la diapositive B à l’envers sur la platine de la diapositive.
4. Cliquez sur le bouton Décharger (Figure 2) pour sortir le dispositif de collecte. Insérez un tube de réaction en chaîne par polymérase (PCR) dans le dispositif de collecte et assurez-vous que le tube est maintenu fixe. Cliquez sur le bouton OK (Figure 3).
5. Sélectionnez un bouchon en cliquant sur le cercle rouge correspondant à l’icône Dispositif collecteur : Bouchons de tubes. Le cercle sélectionné deviendra vert.
6. Cliquez sur le bouton Dessiner et sur le bouton Dessiner + Couper et utilisez la souris pour esquisser la zone d’intérêt.
7. Cliquez sur le bouton Start Cut (Démarrer la coupe ) pour capturer la zone d’intérêt ; l’échantillon prélevé sera prélevé par le bouchon (figure 4).
8. Cliquez sur le bouton Lower (Inférieur ) pour vous assurer que l’échantillon capturé est prélevé (Figure 5).
9. Cliquez sur le bouton Specimen (Échantillon ) pour capturer l’échantillon suivant.
10. Cliquez sur le bouton Décharger pour décharger le tube PCR contenant l’échantillon capturé.

Résultats

En effectuant une microdissection laser des tissus OSF, nous avons capturé des échantillons d’épithélium dysplasique, de stroma sous l’épithélium dysplasique, d’épithélium atrophique et de stroma sous le tissu épithélial atrophique (Figure 1). Grâce à l’extraction de l’ADN et au séquençage du génome entier à faible profondeur, nous avons pu analyser les altérations du nombre de copies (CNA) liées à la morphologie15. L’AIC est une forme c...

Discussion

Ce protocole prévoyait la mise en place d’un pipeline permettant de capturer des échantillons de tissus OSF avec des informations morphologiques et spatiales pour d’autres analyses spatio-omiques par microdissection laser. À partir des résultats représentatifs, nous avons identifié différents modèles d’AIIC parmi divers échantillons liés à la morphologie.

L’OSF, un type d’OPMD, est une affection précancéreuse courante du carcinome épidermoïde buccal^6<...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion microscope slides	CITOTEST	REF.188105
Div-haematoxylin	YiLi	20230326
Eosin solution	BASO	BA4098
Ethanol	PEKING REAGENT	No.32061
Harris hematoxylin dye solution	YiLi	20230326
Hot plate	LEICA	HI1220
Laser capture microdissection system	LEICA	LMD7	Machine
Laser microdissection microsystem	LEICA	8.2.3.7603	Software
Micromount mounting medium	LEICA	REF.3801731
Microscope cover glass	CITOTEST	REF.10212450C
Microtome	LEICA	RM2235
PCR tubes	AXYGEN	16421959
PEN-membrane slides	LEICA	No.11505158
Re-blue solution	YiLi	20230326
Ultrapure distilled water	Invitrogen	REF.10977-015
Xylene	PEKING REAGENT	No.33535