一种用于大规模生产内体衍生囊泡的磁分离辅助高速均质化方法

摘要

在这里，我们描述了一种用于大规模生产内体衍生纳米囊泡的磁分离辅助高速均质化方法，作为一种新型的外泌体模拟物 （EM），它们具有相同的生物学起源和相似的结构、形态和蛋白质组成天然细胞外囊泡 （EVs）。

摘要

细胞外囊泡（EVs）在生理病理研究、疾病诊断和治疗中备受关注;然而，由于缺乏放大生产方法，它们的临床转化受到限制。因此，该协议为大规模生产内体衍生的纳米囊泡提供了一种磁分离辅助的高速均质化方法，作为一种源自内体的新型外泌体模拟物（EMs），其产率比传统的超速离心方法高出约100倍。在这种方法中，磁性纳米颗粒（MNPs）通过内吞作用被亲本细胞内化，随后在其内体中积累。然后，收集负载MNPs的内体，并通过低渗处理和磁分离进行纯化。使用高速均质器将负载MNP的内体分解成单分散的纳米囊泡。由此产生的内体衍生囊泡具有相同的生物起源和结构，其特征是纳米颗粒跟踪分析、透射电子显微镜和蛋白质印迹。它们的形态和蛋白质组成与天然 EV 相似，表明 EM 可能作为天然 EV 的低成本和高产量替代品，用于临床转化。

引言

细胞外囊泡 （EV） 是几乎所有细胞分泌的小囊泡，大小范围为 30-150 nm，含有丰富的生物活性物质。根据来源细胞的不同，EV 表现出高度异质性，具有亲本细胞特异性的多种成分¹。EV 被释放到体液中并运输到远处，在那里它们被靶细胞吸收以发挥作用²，可用于递送用于组织修复、肿瘤诊断和治疗以及免疫调节的各种生物活性分子和药物 ^3,4。然而，体液中具有相似生物物理特性的其他生物纳米颗粒（例如脂蛋白）和纳米囊泡（例如，来自非内体途径的 EV）不可避免地会影响 EV 的分离和纯化。迄今为止，超速离心仍然是 EV 分离的金标准，并且已经开发了其他分离方法，包括蔗糖密度梯度离心、超滤、聚乙二醇沉淀、色谱和免疫磁珠分离⁵。目前限制 EV 疗法临床转化和商业化的瓶颈是严重缺乏能够实现 EV 高度可扩展和可重复分离的分离技术 ^6,7,8。传统的EV分离技术（如超速离心和尺寸排阻色谱）产量低（1 x 10^7-1 x 10⁸/1 x 10^6个细胞

研究方案

注：该方法的示意图如 图1所示。

1. 电磁脉冲制备与隔离

1. MNP的细胞内化
   1. 细胞培养
      1. 将 1 × 10⁶ 只大鼠骨髓间充质干细胞 （BMSC）、293T 细胞或小鼠卵巢上皮癌细胞 （ID8） 悬浮在含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 5% 青霉素-链霉素溶液 （P/S） 的 DMEM 完全培养基中，溶于 2 mL 每 6 孔板（参见 材料表）。
      2. 将细胞在37°C和5%CO₂下培养过夜。
         注意：粘附后的细胞数约为 1 ×^{10 6}。
   2. MNP的内吞作用
      1. 将每个六孔板的培养基体积减小至 1 mL。用浓度为100μg/ 1×10⁶个细胞的10nm聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒（IONP）（参见材料表）共同培养细胞，并在37°C下在含有5%CO₂的气氛中孵育12小时，以使细胞完全内吞IONPs。
2. 内体的分离和均质化
   1. 细胞低渗治疗
      1. 用 0.5 mL/孔胰蛋白酶消化已完全内化 IONP ....

讨论

作为无细胞疗法和纳米级药物递送系统的替代品，EV尚未达到其临床预期，主要障碍是缺乏可扩展和可重复的生产和纯化方法⁶。因此，各种类型的 EM 已被开发为具有相似生物复杂性的 EV 类似物¹⁴。迄今为止，最常用的EM例子是细胞质膜衍生的纳米囊泡。通过直接挤出整个母体细胞¹⁷，这种纳米囊泡的制备相对容易和直接。然而，由于两个缺点?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin antibody	ABclonal	A11235	Western blotting
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Calnexin	GeneTex	HL1598	Western blotting
CD63 antibody	ABclonal	A19023	Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP	Beyotime	P0013	Western blotting
Centrifuge	Beckman	Allegra X-30R	Cell centrifuge
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	NIKON	A1 HD25	Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)	GIBCO	C11995500BT	Cell culture
Dynamic light scattering (DLS)	Malvern	Zetasizer Nano ZS ZEN3600	Diameter analysis
Electric glass homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	DY89-II	Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS	system Bioscience	EXO-FBS-50A-1	Cell culture
High-speed homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	XHF-DY	High-speed homogenization
Magnetic grate	Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)	NA	Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT	The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag1100-10	Cell culture
Potassium chloride	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail	Beyotime	P1030	Proteinase inhibitor
Sodium citrate	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100plus	Morphology image
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers	Particle Metrix	PMX120	Nanoparticle tracking analysis