Endozom kaynaklı veziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı homojenizasyon yöntemi

Özet

Burada, aynı biyolojik kökeni ve doğal hücre dışı veziküllerin (EV'ler) benzer yapısını, morfolojisini ve protein bileşimini paylaşan yeni bir tür eksozom taklitleri (EM'ler) olarak endozomdan türetilmiş nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemini açıklıyoruz.

Özet

Hücre dışı veziküller (EV'ler) fizyolojik ve patolojik araştırmalarda, hastalık teşhisinde ve tedavisinde büyük ilgi görmüştür; Bununla birlikte, klinik çevirileri, ölçek büyütme üretim yaklaşımlarının eksikliği nedeniyle sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, bu protokol, geleneksel ultrasantrifüjleme yönteminden yaklaşık 100 kat daha yüksek verime sahip olan endozomlardan türetilen yeni bir eksozom taklitleri (EM'ler) türü olarak endozom türevli nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemi sağlar. Bu yöntemde, manyetik nanopartiküller (MNP'ler) ebeveyn hücreleri tarafından endositoz yoluyla içselleştirildi ve daha sonra endozomlarında biriktirildi. Daha sonra MNP yüklü endozomlar toplanarak hipotonik tedavi ve manyetik ayırma ile saflaştırıldı. MNP yüklü endozomları monodispers nanoveziküllere ayırmak için yüksek hızlı bir homojenizatör kullanıldı. Elde edilen endozom türevli veziküller, nanopartikül izleme analizi, transmisyon elektron mikroskobu ve western blotlama ile karakterize edilen aynı biyolojik kökene ve yapıya sahiptir. Morfolojileri ve protein bileşimleri doğal EV'lere benzer, bu da EM'lerin potansiyel olarak klinik çeviriler için yerel EV'lerin düşük maliyetli ve yüksek verimli bir vekili olarak hizmet edebileceğini gösterir.

Giriş

Hücre dışı veziküller (EV'ler), hemen hemen tüm hücreler tarafından salgılanan, 30-150 nm boyut aralığında, bol miktarda biyoaktif madde içeren küçük veziküllerdir. Orijin hücreye bağlı olarak, EV'ler yüksek heterojenlik gösterir ve ana hücrelere özgü birden fazla bileşene sahiptir¹. EV'ler vücut sıvılarına salınır ve doku onarımı, tümör teşhisi ve tedavisi ve bağışıklık modülasyonu için çok çeşitli biyoaktif moleküller ve ilaçlar sağlamak için kullanılabilen^{eylem 2} için hedef hücreler tarafından alındıkları uzak bölgelere taşınır ^3,4. Bununla birlikte, vücut sıv....

Protokol

NOT: Yöntemin şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. EM hazırlığı ve izolasyonu

1. MNP'lerin hücre içselleştirmesi
   1. Hücre kültürü
      1. 1 × 10⁶ sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC), 293T hücreleri veya Fare yumurtalık epitel kanseri hücrelerini (ID8) DMEM tam ortamında% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 5 penisilin-streptomisin çözeltisi (P / S) altı oyuklu plaka başına 2 mL'de askıya alın (bkz.
      2. Hücreleri gece boyunca 37 °C ve% 5 CO_2'de kültürleyin.
         NOT: Yapışmadan sonraki hücre sayısı yaklaşık 1 × 10⁶ idi.<....

Tartışmalar

Hücresiz terapinin ve nano ölçekli bir ilaç dağıtım sisteminin bir vekili olarak, EV'ler henüz klinik beklentilerini karşılamamıştır ve ana engel, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir üretim ve saflaştırma yöntemlerinin olmamasıdır⁶. Bu nedenle, benzer biyolojik karmaşıklığa sahip EV analogları olarak çeşitli EM türleri geliştirilmiştir¹⁴. Bugüne kadar, en yaygın kullanılan EM örneği, hücre plazma zarından türetilmiş nanoveziküllerdir. .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin antibody	ABclonal	A11235	Western blotting
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Calnexin	GeneTex	HL1598	Western blotting
CD63 antibody	ABclonal	A19023	Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP	Beyotime	P0013	Western blotting
Centrifuge	Beckman	Allegra X-30R	Cell centrifuge
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	NIKON	A1 HD25	Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)	GIBCO	C11995500BT	Cell culture
Dynamic light scattering (DLS)	Malvern	Zetasizer Nano ZS ZEN3600	Diameter analysis
Electric glass homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	DY89-II	Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS	system Bioscience	EXO-FBS-50A-1	Cell culture
High-speed homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	XHF-DY	High-speed homogenization
Magnetic grate	Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)	NA	Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT	The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag1100-10	Cell culture
Potassium chloride	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail	Beyotime	P1030	Proteinase inhibitor
Sodium citrate	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100plus	Morphology image
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers	Particle Metrix	PMX120	Nanoparticle tracking analysis