Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui, descrevemos um método de homogeneização de alta velocidade assistido por separação magnética para produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo como um novo tipo de imitação de exossomos (MEs) que compartilham a mesma origem biológica e estrutura, morfologia e composição proteica semelhantes de vesículas extracelulares nativas (EVs).

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs) têm atraído atenção significativa em pesquisas fisiológicas e patológicas, diagnóstico e tratamento de doenças; no entanto, sua tradução clínica tem sido limitada pela falta de abordagens de fabricação em escala. Portanto, este protocolo fornece um método de homogeneização de alta velocidade assistido por separação magnética para a produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo como um novo tipo de imitação de exossomos (MEs) derivados dos endossomos, que têm rendimento cerca de 100 vezes maior do que o método convencional de ultracentrifugação. Neste método, nanopartículas magnéticas (MNPs) foram internalizadas pelas células parentais via endocitose e foram posteriormente acumuladas dentro de seus endossomos. Em seguida, endossomos carregados com MNPs foram coletados e purificados por tratamento hipotônico e separação magnética. Um homogeneizador de alta velocidade foi utilizado para quebrar endossomos carregados com MNP em nanovesículas monodispersas. As vesículas derivadas do endossomo resultantes apresentam a mesma origem biológica e estrutura, caracterizadas por análise de rastreamento de nanopartículas, microscópio eletrônico de transmissão e western blotting. Sua morfologia e composição proteica são semelhantes às EVs nativas, indicando que as MEs podem potencialmente servir como substitutas de baixo custo e alto rendimento de EVs nativas para traduções clínicas.

Introdução

Vesículas extracelulares (EVs) são pequenas vesículas secretadas por quase todas as células com uma faixa de tamanho de 30-150 nm, contendo substâncias bioativas abundantes. Dependendo da célula de origem, os EVs apresentam alta heterogeneidade, possuindo múltiplos componentes específicos das células-mãe1. Os EVs são liberados em fluidos corporais e transportados para locais distantes, onde são absorvidos pelas células-alvo para a ação2, que podem ser utilizados para fornecer uma ampla gama de moléculas bioativas e fármacos para reparo tecidual, diagnóstico e tratamento tumoral e modulação imunológica 3,4. No entanto, outras nanopartículas biológicas (por exemplo, lipoproteínas) e nanovesículas (por exemplo, EVs derivados de vias não endossomais) com propriedades biofísicas semelhantes em fluidos corporais inevitavelmente afetam o isolamento e a purificação de EV. Até o momento, a ultracentrifugação continua sendo o padrão ouro para o isolamento de EV, e outros métodos de isolamento, incluindo centrifugação por gradiente de densidade de sacarose, ultrafiltração, precipitação de polietilenoglicol, cromatografia e isolamento de esferas imunomagnéticas, foram desenvolvidos5. O gargalo atual que limita a tradução clínica e a comercialização da terapêutica de EV é a grave falta de técnicas de isolamento que permitam o isolamento altamente escalável e reprodutível dos EVs 6,7,8. As técnicas tradicionais de isolamento de EV (por exemplo, ultracentrifugação e cromatografia de exclusão de tamanho) sofrem de baixo rendimento (1 x 107-1 x 108/1 x 106 células), longo ciclo de produção (24-48 h), baixa reprodutibilidade da qualidade do produto e requerem equipamentos de produção caros e intensivos em energia que não podem atender à demanda clínica atual de EVs6.

Os exossomos miméticos (EMs), substitutos sintéticos de EVs nativos, têm atraído atenção importante devido à sua estrutura, função e escalabilidade altamente semelhantes na produção. A principal fonte de MEs provém da extrusão direta de células parentais inteiras com secção contínua 9,10, demonstrando potentes funções biológicas como EVs nativas11,12. Por exemplo, os MEs derivados de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (hUCMSCs) exercem efeitos de cicatrização semelhantes aos EVs nativos e são mais ricos em composição proteica13. Embora os MEs derivados de células inteiras tenham a complexidade biológica dos EVs, sua principal desvantagem é a heterogeneidade dos produtos, porque eles são inevitavelmente contaminados por várias organelas celulares e detritos celulares. A análise da localização de proteínas revelou ainda que os MEs derivados da extrusão de células inteiras contêm muitas proteínas não-EVs específicas da mitocôndria e do retículo endoplasmático13. Além disso, a maioria dos métodos de fabricação de MEs ainda requer ultracentrifugação, um processo altamente demorado e que consome energia14. Considerando o fato de que os exossomos são exclusivamente derivados de endossomos celulares, levantamos a hipótese de que nanovesículas derivadas de endossomos biomodificados podem recapitular melhor a homologia biológica entre exossomos e MEs em comparação com os MEs derivados da membrana celular bem estabelecidos produzidos pelo método de extrusão de célulasinteiras 14. No entanto, a fabricação de nanovesículas derivadas do endossomo é difícil devido à falta de abordagens viáveis.

Estudos clínicos têm sido realizados utilizando EVs como substituto da terapia livre de células e um sistema de liberação de fármacos em nanoescala para o tratamento de várias doenças. Por exemplo, EVs derivados de células-tronco mesenquimais da medula óssea foram usados para tratar pneumonia grave causada por COVID-19 e alcançaram resultados promissores. Recentemente, EVs geneticamente modificados carregando proteínas CD24 também demonstraram benefícios terapêuticos potentes para o tratamento de pacientes com COVID-1915,16. No entanto, a necessidade clínica da terapia EV ainda não pode ser atendida com os métodos tradicionais de isolamento, devido ao baixo rendimento e custo. Este estudo relata a produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo através de uma abordagem de homogeneização de alta velocidade assistida por separação magnética. Ele aproveita a via de endocitose de MNPs para isolar endossomos carregados com MNP via separação magnética, seguida de homogeneização de alta velocidade para formular endossomos em nanovesículas monodispersas. Como os tipos de endossomos coletados por este protocolo são diversos, mais pesquisas ainda são necessárias para estabelecer boas práticas de fabricação (BPF) na indústria. Esta nova abordagem de preparação de EM é mais eficiente em termos de tempo (5 min de homogeneização de alta velocidade) para obter nanovesículas homólogas a EVs nativos. Produz exponencialmente mais vesículas a partir das mesmas quantidades de células do que a ultracentrifugação, que pode ser geralmente aplicada a vários tipos celulares.

Protocolo

Observação : um esquema do método é mostrado na Figura 1.

1. Preparação e isolamento de EM

  1. Internalização celular de MNPs
    1. Cultura celular
      1. Suspender 1 × 10 6 células-tronco mesenquimais de medula óssea de rato (BMSC), células 293T oucélulas de câncer epitelial de ovário de camundongo (ID8) em meio DMEM completo com soro fetal bovino (FBS) a 10% e solução de penicilina-estreptomicina (P/S) a 5% em 2 mL por placa de seis poços (ver Tabela de Materiais).
      2. Cultivar as células durante a noite a 37 °C e 5% CO2.
        NOTA: O número de células após a adesão foi de cerca de 1 × 106.
    2. Endocitose de MNPs
      1. Reduzir o volume médio de cada placa de seis poços para 1 mL. Co-cultivar as células com nanopartículas de óxido de ferro (IONPs) modificadas com polilisina a 10 nm (ver Tabela de Materiais) a uma concentração de 100 μg/1 × 106 células e incubar a 37 °C numa atmosfera contendo 5% de CO2 durante 12 h para permitir que as células endocitose totalmente as IONPs.
  2. Isolamento e homogeneização de endossomos
    1. Tratamento hipotônico celular
      1. Digerir as células que internalizaram totalmente as IONPs com 0,5 mL/bem de tripsina por 3 min e finalizar a digestão adicionando 1 mL/meio bem completo.
      2. Centrifugar a 1000 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em solução salina tampão fosfato (PBS) e centrífuga, repetidamente duas vezes para lavar o meio residual e as IONPs não absorvidas.
      3. Finalmente, ressuspenda o pellet em 8 mL em solução hipotônica pré-preparada (cloreto de potássio 71,4 mM, citrato de sódio 1,3 mM, pH 7,2-7,4) por 15 min (ver Tabela de Materiais).
    2. Liberação de organelas por homogeneização em baixa velocidade
      1. Transfira a suspensão celular em solução hipotônica para um tubo de ensaio de vidro e libere as organelas usando um homogeneizador de vidro (ver Tabela de Materiais) por 20 choques a 1000 rpm.
    3. Separação magnética para obtenção de endossomos
      1. Transfira 1 mL da solução celular homogeneizada para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e coloque em um separador magnético por 1 h para separar completamente os endossomos carregados com IONP de outras organelas (como núcleo e mitocôndrias) e detritos celulares.
      2. Coletar os pellets marrons na superfície de contato dos tubos de microcentrífuga próximos ao quadro magnético (ver Tabela de Materiais), ou seja, os endossomos carregados com IONP. Descarte o líquido nos tubos de microcentrífuga e adicione 3 mL de PBS para ressuspender os endossomos.
  3. Homogeneização de alta velocidade
    1. Transferir a solução contendo os endossomos para um tubo centrífugo de 15 mL com volume líquido entre 3-10 mL.
    2. Estenda a sonda de 10 mm do homogeneizador de alta velocidade (ver Tabela de Materiais) até o fundo do tubo da centrífuga sem tocar na parte inferior. Ajuste o botão Velocidade sob a tela, defina a velocidade para 140 x g e ajuste o botão Tempo para definir o tempo de 5 minutos e pressione o botão OK .
    3. Pressione o botão Iniciar para realizar a homogeneização depois de colocar uma caixa de gelo sob a amostra.
  4. Classificação magnética para EMs
    1. Transferir a solução contendo nanovesículas obtidas da homogeneização em alta velocidade para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e colocá-la em um separador magnético por 1 h.
    2. Recolha o líquido que contém os EMs necessários. Tenha cuidado para não tocar na superfície dos tubos próximos à estrutura magnética, que adsorveu IONPs livres e EMs carregados com IONP.

2. Caracterização da MP (Figura 2 e Figura 3)

  1. Análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS)
    1. Injetar 1 mL de amostra de MEs (20 μg/mL) ao longo da parede na cubeta e colocá-la no slot de amostra do instrumento DLS (ver Tabela de Materiais).
    2. Abra o software DLS, selecione Teste de tamanho de partícula e inicie o teste.
    3. Meça a concentração de proteínas usando um kit de ensaio de proteína BCA (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
    1. Diluir os MEs com PBS para uma solução a 1 × 107-1 ×10 8 partículas/mL e injetá-los na câmara do instrumento NTA (ver Tabela de Materiais) usando uma seringa de 1 mL a uma taxa de fluxo de 500-1000 μL/min.
    2. Abra os 488 canais laser e certifique-se de que o número de EMs na interface do software esteja entre 100-300 e em movimento browniano.
    3. De acordo com o protocolo do fabricante, selecione o POP apropriado (EV-488) para garantir que a sensibilidade do instrumento seja adequada para a detecção de EM.
  3. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
    1. Fixar os MEs (1 mg/mL) com igual volume de glutaraldeído a 5% por 30 min e quantificar a concentração de MEs como 1 mg/mL pelo kit de ensaio proteico BCA.
    2. Coloque uma gota de 10 μL de EMs no lado de carbono da malha de cobre e remova o excesso de líquido do lado com papel de filtro após 10 min. Adicione 10 μL de PBS e borre imediatamente com papel de filtro. Repita duas vezes para remover o excesso de glutaraldeído.
    3. Soltar 5 μL do contraste acetato de uranila e corar negativamente por 1 minuto e, em seguida, remover o excesso de contraste. Lavar três vezes com água deionizada e secar à temperatura ambiente (TR).
    4. Grave a imagem por um MET a uma tensão de aceleração de 100 kV.
  4. Mancha ocidental
    1. Adicionar 100 μL de tampão de lise celular e 5 μL de um cocktail de inibidores de protease de 50x às amostras (ver Tabela de Materiais). Misture delicadamente com uma pistola de pipeta e coloque no gelo por 30 min.
    2. Centrifugar a solução a 1000 x g durante 10 min a 4 °C, quantificar a concentração proteica do sobrenadante com um kit de ensaio de proteína BCA e recolher.
    3. Misturar o sobrenadante de 100 μL com 25 μL de tampão de carga proteico de 5x e aquecer a 95 °C durante 10 minutos.
    4. Preparar géis de acordo com as instruções dos géis pré-formados. Carregar 15 μg de proteína por poço e executar por eletroforese em gel a 80 V. Espere a amostra correr para o gel de separação, mude para 100 V e, em seguida, transfira a proteína para uma membrana de nitrocelulose a 100 V, 60 min sob banho de gelo.
    5. Detectar os marcadores não específicos de EV (Calnexina) e biomarcadores de EV (Anexina e CD63) por western blotting (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Os anticorpos são diluídos de acordo com as recomendações do fabricante.

3. Detecção in vitro da função EM

  1. Rotulagem de EMs
    1. Misturar 1 μL de PKH26 com 250 μL de diluente C (1:250) para fazer 2x solução corante (4 × 10-6 M) (ver Tabela de Materiais).
    2. Misturar 250 μL de MEs (1 mg/mL) com 250 μL de solução corante 2x e soprar rapidamente com uma pistola de pipetagem.
    3. Incubar em RT por 2-5 min enquanto inverte suavemente o tubo da centrífuga.
    4. Adicione um volume igual de soro ou 1% de proteína de soro bovino e incube por 1 min para terminar a digestão.
    5. Remova o excesso de PKH26 por ultrafiltração com tubos de ultrafiltração de 1000 KD a 3000 x g por 30 minutos e repita três vezes adicionando PBS. Ressuspender o líquido restante para 500 μL com PBS e filtrar através de um filtro de 0,22 μm.
  2. Ensaio de captação de células
    1. Inoculação celular: Sementes 1 × 106 células em placas confocais de 35 mm com 1 mL de DMEM contendo 10% de SFB e 5% de P/S, e incubar a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite.
    2. Filtre os MEs com filtros de seringa estéreis de 0,22 μm para remover possíveis contaminações.
    3. Tratar as células com MEs marcados com PKH26 (10a 9 partículas/mL) por 8 h.
    4. Lavar três vezes com PBS, adicionar DAPI (10 ng/mL) e incubar por 10 min em TR.
    5. Adquira as imagens de fluorescência em microscopia confocal de varredura a laser usando os canais de laser de 405 nm e 561 nm (ver Tabela de Materiais).

Resultados

O fluxo de trabalho da preparação de EM por homogeneização de alta velocidade assistida por separação magnética é mostrado na Figura 1. As células internalizam IONPs modificadas com polilisina a 10 nm, que são especificamente acumuladas nos endossomos via endocitose (Figura 3A). Após serem tratados com tampão hipotônico e homogeneizados, os endossomos carregados com IONP são liberados das células e posteriormente coletados por separação magnéti...

Discussão

Como substituto da terapia livre de células e de um sistema de liberação de fármacos em nanoescala, os EVs ainda não atenderam às suas expectativas clínicas, e um dos principais obstáculos é a falta de métodos escaláveis e reprodutíveis de produção e purificação6. Portanto, vários tipos de MEs têm sido desenvolvidos como análogos de EV com complexidade biológica semelhante14. Até o momento, o exemplo de EM mais comumente usado são as nanovesículas der...

Divulgações

D.W. e P.G. são co-inventores de um pedido de patente depositado pelo Instituto de Medicina Básica e Câncer (IBMC), Academia Chinesa de Ciências. O outro autor declara não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o uso de instrumentos no Shared Instrumentation Core Facility do Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Academia Chinesa de Ciências. Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC; 82172598), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang, China (LZ22H310001), o Projeto de Treinamento de Talentos em Saúde 551 da Comissão de Saúde da Província de Zhejiang, China, o Projeto de Pesquisa de Desenvolvimento Agrícola e Social do Departamento Municipal de Ciência e Tecnologia de Hangzhou (2022ZDSJ0474) e a Bolsa de Pesquisa Interdisciplinar de Qiantang.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Annexin antibodyABclonalA11235Western blotting
BCA assay kitBeyotimeP0012Protein concentration assay
CalnexinGeneTexHL1598Western blotting
CD63 antibodyABclonalA19023Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IPBeyotimeP0013Western blotting
CentrifugeBeckmanAllegra X-30RCell centrifuge
CO2 incubatorThermoCell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopyNIKONA1 HD25Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)GIBCOC11995500BTCell culture
Dynamic light scattering (DLS)MalvernZetasizer Nano ZS ZEN3600Diameter analysis
Electric glass homogenizerSCIENTZ(Ningbo, China)DY89-IILow-speed homogenization
Exosome-depleted FBSsystem BioscienceEXO-FBS-50A-1Cell culture
High-speed homogenizerSCIENTZ(Ningbo, China)XHF-DYHigh-speed homogenization
Magnetic grateTuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)NAMagnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane LabelingSigma-AldrichPKH26GL-1KTThe kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)Mag1100-10Cell culture
Potassium chlorideAladdin7447-40-7Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktailBeyotimeP1030Proteinase inhibitor
Sodium citrateAladdin7447-40-7Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)JEOLJEM-2100plusMorphology image
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN-100Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzersParticle MetrixPMX120Nanoparticle tracking analysis

Referências

  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
  2. Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
  3. Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
  4. Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  5. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  6. Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  7. Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
  8. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
  9. Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
  10. Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
  11. Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
  12. Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
  13. Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
  14. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
  15. Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
  16. Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
  17. Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
  18. Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
  19. Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
  20. Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Este m s no JoVEedi o 203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados