Ein magnetabscheidungsunterstütztes Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsverfahren für die großtechnische Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Vesikeln

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir eine magnetische Separations-gestützte Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsmethode für die großtechnische Produktion von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln als eine neue Art von Exosomen-Mimikern (EMs), die den gleichen biologischen Ursprung und die gleiche Struktur, Morphologie und Proteinzusammensetzung von nativen extrazellulären Vesikeln (EVs) aufweisen.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) haben in der physiologischen und pathologischen Forschung, Krankheitsdiagnose und -behandlung große Aufmerksamkeit erregt. Ihre klinische Umsetzung wurde jedoch durch das Fehlen von Scale-up-Fertigungsansätzen eingeschränkt. Daher bietet dieses Protokoll eine magnetische Separations-unterstützte Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsmethode für die großtechnische Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln als eine neue Art von Exosomen-Mimiks (EMs), die von den Endosomen abgeleitet sind und eine etwa 100-mal höhere Ausbeute als die herkömmliche Ultrazentrifugationsmethode aufweisen. Bei dieser Methode wurden magnetische Nanopartikel (MNPs) von den Elternzellen mittels Endozytose internalisiert und anschließend in ihren Endosomen akkumuliert. Anschließend wurden MNPs-beladene Endosomen gesammelt und durch hypotone Behandlung und magnetische Trennung gereinigt. Ein Hochgeschwindigkeits-Homogenisator wurde verwendet, um MNP-beladene Endosomen in monodisperse Nanovesikel zu zerlegen. Die resultierenden Endosomen-abgeleiteten Vesikel weisen den gleichen biologischen Ursprung und die gleiche Struktur auf, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, Transmissionselektronenmikroskop und Western Blot gekennzeichnet sind. Ihre Morphologie und Proteinzusammensetzung ähneln nativen EVs, was darauf hindeutet, dass EMs möglicherweise als kostengünstiger und ertragreicher Ersatz für native EVs für klinische Translationen dienen können.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind kleine Vesikel, die von fast allen Zellen mit einem Größenbereich von 30-150 nm abgesondert werden und reichlich bioaktive Substanzen enthalten. Abhängig von der Ursprungszelle weisen EVs eine hohe Heterogenität auf und besitzen mehrere Komponenten, die spezifisch für Elternzellen^{sind 1}. EVs werden in Körperflüssigkeiten freigesetzt und an entfernte Orte transportiert, wo sie von Zielzellen für Aktion² aufgenommen werden, die zur Verabreichung einer breiten Palette von bioaktiven Molekülen und Medikamenten für die Gewebereparatur, die Tumordiagnose und -behandlung sowie die Immunmodulation verwendet werden^{können 3,4}. Andere biologische Nanopartikel (z. B. Lipoproteine) und Nanovesikel (z. B. EVs, die aus nicht-endosomalen Signalwegen stammen) mit ähnlichen biophysikalischen Eigenschaften in Körperflüssigkeiten beeinflussen jedoch unweigerlich die Isolierung und Reinigung von EV. Bis heute ist die Ultrazentrifugation der Goldstandard für die Isolierung von Elektrofahrzeugen, und es wurden andere Isolationsmethoden entwickelt, darunter Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, Ultrafiltration, Polyethylenglykolfällung, Chromatographie und immunmagnetische Bead-Isolierung⁵. Der derzeitige Engpass, der die klinische Translation und Kommerzialisierung von EV-Therapeutika einschränkt, ist der gravierende Mangel an Isolationstechniken, die eine hochgradig skalierbare und reproduzierbare Isolierung von EVs ermöglichen ^6,7,8. Herkömmliche EV-Isolationstechniken (z. B. Ultrazentrifugation und Größenausschlusschromatographie) leiden unter einer geringen Ausbeute (1 x 10^7-1 x 10⁸/1 x 10⁶ Zellen), einem langen Produktionszyklus (24-48 h), einer schlechten Reproduzierbarkeit der Produktqualität und erfordern teure und energieintensive Produktionsanlagen, die die derzeitige klinische Nachfrage nach Elektrofahrzeugen nicht decken^{können 6}.

Exosomen-Mimics (EMs), synthetische Surrogate nativer Elektrofahrzeuge, haben aufgrund ihrer sehr ähnlichen Struktur, Funktion und Skalierbarkeit in der Produktion große Aufmerksamkeit erregt. Die Hauptquelle für EMs ist die direkte Extrusion ganzer Elternzellen mit kontinuierlicher Sektion^9,10, was starke biologische Funktionen als native EVs zeigt^11,12. Zum Beispiel üben EMs, die aus mesenchymalen Stammzellen der menschlichen Nabelschnur (hUCMSCs) gewonnen werden, ähnliche Wundheilungseffekte aus wie native EVs und sind reicher in der Proteinzusammensetzung¹³. Obwohl EMs, die aus ganzen Zellen gewonnen werden, die biologische Komplexität von EVs aufweisen, ist ihr Hauptnachteil die Heterogenität der Produkte, da sie unweigerlich durch verschiedene Zellorganellen und Zelltrümmer kontaminiert werden. Die Analyse der Proteinlokalisierung ergab außerdem, dass EMs, die aus der Ganzzellextrusion stammen, viele nicht-EVs-spezifische Proteine aus Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum enthalten¹³. Darüber hinaus erfordern die meisten Verfahren zur Herstellung von EMs immer noch eine Ultrazentrifugation, ein sehr zeit- und energieaufwändiger Prozess¹⁴. In Anbetracht der Tatsache, dass Exosomen ausschließlich von zellulären Endosomen abgeleitet werden, stellten wir die Hypothese auf, dass biotechnologisch hergestellte Endosomen-abgeleitete Nanovesikel die biologische Homologie zwischen Exosomen und EMs besser rekapitulieren können als die etablierten EMs aus der Zellmembran, die durch die Ganzzellextrusionsmethode hergestellt werden¹⁴. Dennoch ist die Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln aufgrund des Mangels an praktikablen Ansätzen schwierig.

Klinische Studien wurden durchgeführt, indem EVs als Surrogat für eine zellfreie Therapie und als nanoskaliges Arzneimittelverabreichungssystem für die Behandlung verschiedener Krankheiten verwendet wurden. So wurden beispielsweise aus mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks gewonnene EVs zur Behandlung schwerer Lungenentzündungen eingesetzt, die durch COVID-19 verursacht wurden, und haben vielversprechende Ergebnisse erzielt. In jüngster Zeit haben gentechnisch veränderte Elektrofahrzeuge, die CD24-Proteine tragen, auch einen starken therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von COVID-19-Patienten gezeigt^15,16. Der klinische Bedarf der EV-Therapie kann jedoch aufgrund der geringen Ausbeute und Kosten immer noch nicht mit herkömmlichen Isolationsmethoden erfüllt werden. Diese Studie berichtet über die großtechnische Produktion von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln über einen magnetabscheidungsunterstützten Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsansatz. Es nutzt den Endozytoseweg von MNPs, um MNP-beladene Endosomen durch magnetische Trennung zu isolieren, gefolgt von einer Hochgeschwindigkeitshomogenisierung, um Endosomen zu monodispersen Nanovesikeln zu formulieren. Da die Arten von Endosomen, die von diesem Protokoll gesammelt werden, vielfältig sind, ist noch weitere eingehende Forschung erforderlich, um gute Herstellungspraktiken (GMP) in der Industrie zu etablieren. Dieser neuartige EM-Präparationsansatz ist zeiteffizienter (5 Minuten Hochgeschwindigkeitshomogenisierung), um Nanovesikel zu erhalten, die homolog zu nativen EVs sind. Es produziert exponentiell mehr Vesikel aus der gleichen Anzahl von Zellen als die Ultrazentrifugation, die im Allgemeinen auf verschiedene Zelltypen angewendet werden kann.

Protokoll

HINWEIS: Ein Schema des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. EM-Vorbereitung und Isolierung

1. Zellinternalisierung von MNPs
   1. Zellkultur
      1. 1 ×^{10 6} mesenchymale Stammzellen (BMSC), 293T-Zellen oder Eierstockkrebszellen der Maus (ID8) in DMEM-Komplettmedium mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 5 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (P/S) in 2 ml pro Sechs-Well-Platte suspendieren (siehe Materialtabelle).
      2. Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert.
         HINWEIS: Die Anzahl der Zellen nach der Adhärenz betrug etwa 1 × 10⁶.
   2. Endozytose von MNPs
      1. Reduzieren Sie das mittlere Volumen jeder Sechs-Well-Platte auf 1 ml. Die Zellen werden mit 10 nm Polylysin-modifizierten Eisenoxid-Nanopartikeln (IONPs) (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 100 μg/1 × 10⁶ Zellen co-kultiviert und bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO₂ für 12 h inkubiert, damit die Zellen IONPs vollständig endozytieren können.
2. Isolierung und Homogenisierung von Endosomen
   1. Zellhypotone Behandlung
      1. Verdauen Sie die Zellen, die IONPs vollständig internalisiert haben, mit 0,5 ml/Well-Trypsin für 3 Minuten und beenden Sie den Aufschluss durch Zugabe von 1 ml/Well-Komplettmedium.
      2. Bei 1000 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) und zentrifugieren Sie sie wiederholt zweimal, um das Restmedium und die nicht absorbierten IONPs auszuwaschen.
      3. Zum Schluss wird das Pellet in 8 ml in vorgefertigter hypotoner Lösung (71,4 mM Kaliumchlorid, 1,3 mM Natriumcitrat, pH 7,2-7,4) für 15 Minuten resuspendiert (siehe Materialtabelle).
   2. Freisetzung von Organellen durch Homogenisierung mit niedriger Geschwindigkeit
      1. Die Zellsuspension in hypotoner Lösung wird in ein Glasreagenzglas überführt und die Organellen mit einem Glashomogenisator (siehe Materialtabelle) durch 20 Stöße bei 1000 U/min freigesetzt.
   3. Magnetische Trennung zur Gewinnung von Endosomen
      1. 1 ml der homogenisierten Zelllösung in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 1 Stunde lang in einen Magnetabscheider geben, um IONP-beladene Endosomen vollständig von anderen Organellen (wie Zellkern und Mitochondrien) und Zelltrümmern zu trennen.
      2. Sammeln Sie die braunen Pellets auf der Kontaktfläche der Mikrozentrifugenröhrchen neben dem Magnetrahmen (siehe Materialtabelle), d. h. die IONP-beladenen Endosomen. Entsorgen Sie die Flüssigkeit in den Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 3 ml PBS hinzu, um die Endosomen zu resuspendieren.
3. Hochgeschwindigkeits-Homogenisierung
   1. Die Lösung, die die Endosomen enthält, wird in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit einem Flüssigkeitsvolumen zwischen 3-10 ml überführt.
   2. Verlängern Sie die 10-mm-Sonde des Hochgeschwindigkeits-Homogenisators (siehe Materialtabelle) bis zum Boden des Zentrifugenröhrchens, ohne den Boden zu berühren. Stellen Sie die Taste "Geschwindigkeit" unter dem Bildschirm ein, stellen Sie die Geschwindigkeit auf 140 x g ein, stellen Sie die Taste "Zeit" ein, um die Zeit von 5 Minuten einzustellen, und drücken Sie dann die Taste "OK".
   3. Drücken Sie die Start-Taste , um die Homogenisierung durchzuführen, nachdem Sie eine Eisbox unter die Probe gelegt haben.
4. Magnetische Sortierung für EMs
   1. Die aus der Hochgeschwindigkeitshomogenisierung gewonnene Lösung mit Nanovesikeln wird in das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 1 h lang in einen Magnetabscheider gegeben.
   2. Sammeln Sie die Flüssigkeit, die die erforderlichen EMs enthält. Achten Sie darauf, die Oberfläche der Röhrchen neben dem Magnetrahmen nicht zu berühren, die freie IONPs und IONP-geladene EMs adsorbieren.

2. EM-Charakterisierung (Abbildung 2 und Abbildung 3)

1. Analyse der dynamischen Lichtstreuung (DLS)
   1. Injizieren Sie 1 ml EMs-Probe (20 μg/ml) entlang der Wand in die Küvette und legen Sie sie in den Probenschlitz des DLS-Instruments (siehe Materialtabelle).
   2. Öffnen Sie die DLS-Software, wählen Sie Partikelgrößentest und starten Sie den Test.
   3. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
2. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
   1. EMs mit PBS zu einer Lösung von 1 × 10^7-1 × 10⁸ Partikeln/ml verdünnt und mit einer 1-ml-Spritze bei einer Durchflussrate von 500-1000 μl/min in die Kammer des NTA-Instruments (siehe Materialtabelle) injiziert.
   2. Öffnen Sie die 488 Laserkanäle und stellen Sie sicher, dass die Anzahl der EMs in der Softwareschnittstelle zwischen 100 und 300 liegt und sich in Brownscher Bewegung befindet.
   3. Wählen Sie gemäß dem Protokoll des Herstellers die geeignete SOP (EV-488) aus, um sicherzustellen, dass die Empfindlichkeit des Geräts für die EM-Detektion geeignet ist.
3. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
   1. Fixieren Sie EMs (1 mg/ml) mit einem gleichen Volumen von 5 % Glutaraldehyd für 30 Minuten und quantifizieren Sie die Konzentration der EMs mit 1 mg/ml mit dem BCA-Protein-Assay-Kit.
   2. Geben Sie einen 10-μl-Tropfen EMs auf die Kohlenstoffseite des Kupfergewebes und entfernen Sie nach 10 Minuten überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier von der Seite. 10 μl PBS zugeben und sofort mit Filterpapier abtupfen. Wiederholen Sie dies zweimal, um überschüssiges Glutaraldehyd zu entfernen.
   3. Geben Sie 5 μl Uranylacetat-Kontrastmittel und färben Sie es 1 Minute lang negativ, dann entfernen Sie das überschüssige Kontrastmittel. Dreimal mit entionisiertem Wasser waschen und bei Raumtemperatur trocknen.
   4. Aufnahme eines Bildes mit einem TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV.
4. Western-Blotting
   1. Zu den Proben werden 100 μl Zelllysepuffer und 5 μl eines 50-fachen Proteaseinhibitor-Cocktails hinzugefügt (siehe Materialtabelle). Mit einer Pipettenpistole vorsichtig mischen und 30 Minuten auf Eis legen.
   2. Die Lösung wird bei 1000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, die Proteinkonzentration des Überstandes mit einem BCA-Protein-Assay-Kit quantifiziert und gesammelt.
   3. Mischen Sie den 100-μl-Überstand mit 25 μl 5-fachem Proteinladepuffer und erhitzen Sie ihn 10 Minuten lang bei 95 °C.
   4. Bereiten Sie die Gele gemäß den Anweisungen der vorgeformten Gele vor. Laden Sie 15 μg Protein pro Vertiefung und lassen Sie es durch Gelelektrophorese bei 80 V laufen. Warten Sie, bis die Probe zum Trenngel läuft, wechseln Sie auf 100 V und übertragen Sie das Protein dann auf eine Nitrozellulosemembran bei 100 V, 60 Minuten unter Eisbad.
   5. Nachweis der nicht-EV-spezifischen Marker (Calnexin) und EV-Biomarker (Annexin und CD63) mittels Western Blot (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Die Antikörper werden gemäß den Empfehlungen des Herstellers verdünnt.

3. In-vitro-EM-Funktionserkennung

1. EM-Kennzeichnung
   1. Mischen Sie 1 μl PKH26 mit 250 μl Verdünnungsmittel C (1:250), um 2x Färbelösung (4 × ^10-6 M) herzustellen (siehe Materialtabelle).
   2. Mischen Sie 250 μl EMs (1 mg/ml) mit 250 μl 2-facher Färbelösung und blasen Sie schnell mit einer Pipettierpistole.
   3. Bei RT für 2-5 Minuten inkubieren, während das Zentrifugenröhrchen vorsichtig umgedreht wird.
   4. Fügen Sie ein gleiches Volumen Serum oder 1 % Rinderserumprotein hinzu und inkubieren Sie 1 Minute lang, um die Verdauung zu beenden.
   5. Entfernen Sie überschüssiges PKH26 durch Ultrafiltration mit 1000 KD-Ultrafiltrationsröhrchen bei 3000 x g für 30 Minuten und wiederholen Sie dies dreimal durch Zugabe von PBS. Resuspendieren Sie die verbleibende Flüssigkeit mit PBS auf 500 μl und filtrieren Sie sie durch einen 0,22-μm-Filter.
2. Zellaufnahme-Assay
   1. Zellinokulation: 1 × 10⁶ Zellen in konfokalen 35-mm-Schalen mit 1 ml DMEM mit 10 % FBS und 5 % P/S aussäen und bei 37 °C und 5 %_CO2 über Nacht inkubieren.
   2. Filtern Sie die EMs mit sterilen 0,22 μm Spritzenfiltern, um mögliche Verunreinigungen zu entfernen.
   3. Behandeln Sie die Zellen 8 Stunden lang mit PKH26-markierten EMs (10⁹ Partikel/ml).
   4. Dreimal mit PBS waschen, DAPI (10 ng/ml) zugeben und 10 Minuten bei RT inkubieren.
   5. Erfassen Sie die Fluoreszenzbilder in der konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie mit den 405-nm- und 561-nm-Laserkanälen (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

Der Arbeitsablauf der EM-Präparation durch magnetabscheidungsgestützte Hochgeschwindigkeitshomogenisierung ist in Abbildung 1 dargestellt. Zellen internalisieren 10 nm Polylysin-modifizierte IONPs, die spezifisch durch Endozytose in Endosomen akkumuliert werden (Abbildung 3A). Nach der Behandlung mit hypotonem Puffer und der Homogenisierung werden die IONP-beladenen Endosomen aus den Zellen freigesetzt und anschließend durch magnetische Trennung gesammelt. Di...

Diskussion

Als Surrogat der zellfreien Therapie und eines nanoskaligen Arzneimittelverabreichungssystems müssen EVs ihre klinischen Erwartungen noch erfüllen, und ein Haupthindernis ist der Mangel an skalierbaren und reproduzierbaren Produktions- und Reinigungsmethoden⁶. Daher wurden verschiedene Arten von EMs als EV-Analoga mit ähnlicher biologischer Komplexität entwickelt¹⁴. Das bisher am häufigsten verwendete EM-Beispiel sind Nanovesikel aus Zellplasmamembranen. Die Herstellun...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin antibody	ABclonal	A11235	Western blotting
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Calnexin	GeneTex	HL1598	Western blotting
CD63 antibody	ABclonal	A19023	Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP	Beyotime	P0013	Western blotting
Centrifuge	Beckman	Allegra X-30R	Cell centrifuge
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	NIKON	A1 HD25	Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)	GIBCO	C11995500BT	Cell culture
Dynamic light scattering (DLS)	Malvern	Zetasizer Nano ZS ZEN3600	Diameter analysis
Electric glass homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	DY89-II	Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS	system Bioscience	EXO-FBS-50A-1	Cell culture
High-speed homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	XHF-DY	High-speed homogenization
Magnetic grate	Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)	NA	Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT	The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag1100-10	Cell culture
Potassium chloride	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail	Beyotime	P1030	Proteinase inhibitor
Sodium citrate	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100plus	Morphology image
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers	Particle Metrix	PMX120	Nanoparticle tracking analysis