Ein magnetabscheidungsunterstütztes Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsverfahren für die großtechnische Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Vesikeln

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir eine magnetische Separations-gestützte Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsmethode für die großtechnische Produktion von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln als eine neue Art von Exosomen-Mimikern (EMs), die den gleichen biologischen Ursprung und die gleiche Struktur, Morphologie und Proteinzusammensetzung von nativen extrazellulären Vesikeln (EVs) aufweisen.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) haben in der physiologischen und pathologischen Forschung, Krankheitsdiagnose und -behandlung große Aufmerksamkeit erregt. Ihre klinische Umsetzung wurde jedoch durch das Fehlen von Scale-up-Fertigungsansätzen eingeschränkt. Daher bietet dieses Protokoll eine magnetische Separations-unterstützte Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsmethode für die großtechnische Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln als eine neue Art von Exosomen-Mimiks (EMs), die von den Endosomen abgeleitet sind und eine etwa 100-mal höhere Ausbeute als die herkömmliche Ultrazentrifugationsmethode aufweisen. Bei dieser Methode wurden magnetische Nanopartikel (MNPs) von den Elternzellen mittels Endozytose internalisiert und anschließend in ihren Endosomen akkumuliert. Anschließend wurden MNPs-beladene Endosomen gesammelt und durch hypotone Behandlung und magnetische Trennung gereinigt. Ein Hochgeschwindigkeits-Homogenisator wurde verwendet, um MNP-beladene Endosomen in monodisperse Nanovesikel zu zerlegen. Die resultierenden Endosomen-abgeleiteten Vesikel weisen den gleichen biologischen Ursprung und die gleiche Struktur auf, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, Transmissionselektronenmikroskop und Western Blot gekennzeichnet sind. Ihre Morphologie und Proteinzusammensetzung ähneln nativen EVs, was darauf hindeutet, dass EMs möglicherweise als kostengünstiger und ertragreicher Ersatz für native EVs für klinische Translationen dienen können.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind kleine Vesikel, die von fast allen Zellen mit einem Größenbereich von 30-150 nm abgesondert werden und reichlich bioaktive Substanzen enthalten. Abhängig von der Ursprungszelle weisen EVs eine hohe Heterogenität auf und besitzen mehrere Komponenten, die spezifisch für Elternzellen^{sind 1}. EVs werden in Körperflüssigkeiten freigesetzt und an entfernte Orte transportiert, wo sie von Zielzellen für Aktion² aufgenommen werden, die zur Verabreichung einer breiten Palette von bioaktiven Molekülen und Medikamenten für die Gewebereparatur, die Tumordiagnose und -behandlung sowie die Immunmodulati....

Protokoll

HINWEIS: Ein Schema des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. EM-Vorbereitung und Isolierung

1. Zellinternalisierung von MNPs
   1. Zellkultur
      1. 1 ×^{10 6} mesenchymale Stammzellen (BMSC), 293T-Zellen oder Eierstockkrebszellen der Maus (ID8) in DMEM-Komplettmedium mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 5 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (P/S) in 2 ml pro Sechs-Well-Platte suspendieren (siehe Materialtabelle).
      2. Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert.
         HINWEIS: Die Anzahl der Zellen nach der Adhärenz betr....

Diskussion

Als Surrogat der zellfreien Therapie und eines nanoskaligen Arzneimittelverabreichungssystems müssen EVs ihre klinischen Erwartungen noch erfüllen, und ein Haupthindernis ist der Mangel an skalierbaren und reproduzierbaren Produktions- und Reinigungsmethoden⁶. Daher wurden verschiedene Arten von EMs als EV-Analoga mit ähnlicher biologischer Komplexität entwickelt¹⁴. Das bisher am häufigsten verwendete EM-Beispiel sind Nanovesikel aus Zellplasmamembranen. Die Herstellun.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin antibody	ABclonal	A11235	Western blotting
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Calnexin	GeneTex	HL1598	Western blotting
CD63 antibody	ABclonal	A19023	Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP	Beyotime	P0013	Western blotting
Centrifuge	Beckman	Allegra X-30R	Cell centrifuge
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	NIKON	A1 HD25	Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)	GIBCO	C11995500BT	Cell culture
Dynamic light scattering (DLS)	Malvern	Zetasizer Nano ZS ZEN3600	Diameter analysis
Electric glass homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	DY89-II	Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS	system Bioscience	EXO-FBS-50A-1	Cell culture
High-speed homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	XHF-DY	High-speed homogenization
Magnetic grate	Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)	NA	Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT	The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag1100-10	Cell culture
Potassium chloride	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail	Beyotime	P1030	Proteinase inhibitor
Sodium citrate	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100plus	Morphology image
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers	Particle Metrix	PMX120	Nanoparticle tracking analysis