엔도솜 유래 소포의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법

요약

여기에서는 엔도솜 유래 나노소포체의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법을 생물학적 기원과 천연 세포외 소포체(EV)의 생물학적 기원과 유사한 구조, 형태 및 단백질 조성을 공유하는 새로운 유형의 엑소좀 모방체(EM)로 설명합니다.

초록

세포외 소포체(EV)는 생리학 및 병리학적 연구, 질병 진단 및 치료에 상당한 관심을 끌고 있습니다. 그러나 그들의 임상 번역은 스케일업 제조 접근 방식의 부족으로 인해 제한되었습니다. 따라서, 본 프로토콜은 엔도솜 유래 엑소좀 모방체(EM)의 새로운 유형으로서 엔도솜 유래 나노소포체의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법을 제공하며, 이는 기존의 초원심분리 방식보다 약 100배 높은 수율을 가지고 있습니다. 이 방법에서 자성 나노 입자(MMP)는 세포내이입(endocytosis)을 통해 부모 세포에 의해 내재화되고 이후 엔도솜 내에 축적되었습니다. 그런 다음, MNP가 로드된 엔도솜을 수집하고 저긴장 처리 및 자기 분리를 통해 정제했습니다. 고속 균질화기는 MNP가 로드된 엔도솜을 단분산 나노소포로 분해하는 데 사용되었습니다. 그 결과 엔도솜 유래 소포는 동일한 생물학적 기원과 구조를 특징으로 하며, 나노 입자 추적 분석, 투과 전자 현미경 및 웨스턴 블로팅을 특징으로 합니다. EM의 형태 및 단백질 조성은 네이티브 EV와 유사하며, 이는 EM이 임상 번역을 위한 네이티브 EV의 저비용 및 고수율 대용품 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

서문

세포외 소포체(EV)는 30-150nm의 크기 범위를 가진 거의 모든 세포에서 분비되는 작은 소포로, 풍부한 생리 활성 물질을 함유하고 있습니다. 기원 세포에 따라 EV는 높은 이질성을 보이며, 모세포에 특이적인 여러 구성 요소를 가지고^{있습니다 1}. EV는 체액으로 방출되어 먼 부위로 운반되어 조직 복구, 종양 진단 및 치료, 면역 조절을 위한 광범위한 생체 활성 분자 및 약물을 전달하는 데 활용될 수 있는 작용^2을 위해 표적 세포에 의해 흡수됩니다 ^3,4. 그러나 체액에서 유사한 생물물리학적 특성을 갖는 다른 생물학적 나노입자(예: 지단백질) 및 나노소포(예: 비엔도솜 경로에서 파생된 EV)는 필연적으로 EV 분리 및 정제에 영향을 미칩니다. 현재까지 초원심분리는 EV 분리의 황금 표준으로 남아 있으며, 자당 밀도 구배 원심분리, 한외여과, 폴리에틸렌 글리콜 침전, 크로마토그래피 및 면역자성 비드 분리를 포함한 기타 분리 방법이 개발되었습니다⁵. EV 치료제의 임상 번역 및 상용화를 제한하는 현재 병목 현상은 EV의 확장성과 재현성이 높은 분리를 허용하는 분리....

프로토콜

참고: 이 방법의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. EM 준비 및 격리

1. MNP의 세포 내재화
   1. 세포 배양
      1. 1 × 10⁶ 개의 쥐 골수 중간엽 줄기 세포(BMSC), 293T 세포 또는 마우스 난소 상피암 세포(ID8)를 6웰 플레이트당 2mL에 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 5% 페니실린-스트렙토마이신 용액(P/S)이 있는 DMEM 완전 배지에 현탁시킵니다( 재료 표 참조).
      2. 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 밤새 세포를 배양합니다.
         참고: 부착 후 세포의 수는 약 1 × 10⁶이었습니다.
   2. MNP의 세포내이입(Endocytosis)
      1. 각 6웰 플레이트의 중간 부피를 1mL로 줄입니다. 100μg/1 × 10⁶ 세포의 농도에서 10nm 폴리리신 변성 산화철 나노입자(IOLP)(재료 표 참조)와 세포를 공동 배양하고 37°C에서 5% CO2를 함유한 분위기에서₁₂시간 동안 배....

토론

무세포 치료제 및 나노 단위 약물 전달 시스템의 대체물인 EV는 아직 임상적 기대치를 충족하지 못했으며, 주요 장애물은 확장 가능하고 재현 가능한 생산 및 정제 방법이 부족하다는 것입니다⁶. 따라서 다양한 유형의 EM이 유사한 생물학적 복잡성을 가진 EV 유사체로 개발되었습니다¹⁴. 현재까지 가장 일반적으로 사용되는 EM의 예는 세포 원형질막 유래 나노소포.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin antibody	ABclonal	A11235	Western blotting
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Calnexin	GeneTex	HL1598	Western blotting
CD63 antibody	ABclonal	A19023	Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP	Beyotime	P0013	Western blotting
Centrifuge	Beckman	Allegra X-30R	Cell centrifuge
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	NIKON	A1 HD25	Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)	GIBCO	C11995500BT	Cell culture
Dynamic light scattering (DLS)	Malvern	Zetasizer Nano ZS ZEN3600	Diameter analysis
Electric glass homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	DY89-II	Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS	system Bioscience	EXO-FBS-50A-1	Cell culture
High-speed homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	XHF-DY	High-speed homogenization
Magnetic grate	Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)	NA	Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT	The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag1100-10	Cell culture
Potassium chloride	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail	Beyotime	P1030	Proteinase inhibitor
Sodium citrate	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100plus	Morphology image
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers	Particle Metrix	PMX120	Nanoparticle tracking analysis