엔도솜 유래 소포의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법

요약

여기에서는 엔도솜 유래 나노소포체의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법을 생물학적 기원과 천연 세포외 소포체(EV)의 생물학적 기원과 유사한 구조, 형태 및 단백질 조성을 공유하는 새로운 유형의 엑소좀 모방체(EM)로 설명합니다.

초록

세포외 소포체(EV)는 생리학 및 병리학적 연구, 질병 진단 및 치료에 상당한 관심을 끌고 있습니다. 그러나 그들의 임상 번역은 스케일업 제조 접근 방식의 부족으로 인해 제한되었습니다. 따라서, 본 프로토콜은 엔도솜 유래 엑소좀 모방체(EM)의 새로운 유형으로서 엔도솜 유래 나노소포체의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법을 제공하며, 이는 기존의 초원심분리 방식보다 약 100배 높은 수율을 가지고 있습니다. 이 방법에서 자성 나노 입자(MMP)는 세포내이입(endocytosis)을 통해 부모 세포에 의해 내재화되고 이후 엔도솜 내에 축적되었습니다. 그런 다음, MNP가 로드된 엔도솜을 수집하고 저긴장 처리 및 자기 분리를 통해 정제했습니다. 고속 균질화기는 MNP가 로드된 엔도솜을 단분산 나노소포로 분해하는 데 사용되었습니다. 그 결과 엔도솜 유래 소포는 동일한 생물학적 기원과 구조를 특징으로 하며, 나노 입자 추적 분석, 투과 전자 현미경 및 웨스턴 블로팅을 특징으로 합니다. EM의 형태 및 단백질 조성은 네이티브 EV와 유사하며, 이는 EM이 임상 번역을 위한 네이티브 EV의 저비용 및 고수율 대용품 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

서문

세포외 소포체(EV)는 30-150nm의 크기 범위를 가진 거의 모든 세포에서 분비되는 작은 소포로, 풍부한 생리 활성 물질을 함유하고 있습니다. 기원 세포에 따라 EV는 높은 이질성을 보이며, 모세포에 특이적인 여러 구성 요소를 가지고^{있습니다 1}. EV는 체액으로 방출되어 먼 부위로 운반되어 조직 복구, 종양 진단 및 치료, 면역 조절을 위한 광범위한 생체 활성 분자 및 약물을 전달하는 데 활용될 수 있는 작용^2을 위해 표적 세포에 의해 흡수됩니다 ^3,4. 그러나 체액에서 유사한 생물물리학적 특성을 갖는 다른 생물학적 나노입자(예: 지단백질) 및 나노소포(예: 비엔도솜 경로에서 파생된 EV)는 필연적으로 EV 분리 및 정제에 영향을 미칩니다. 현재까지 초원심분리는 EV 분리의 황금 표준으로 남아 있으며, 자당 밀도 구배 원심분리, 한외여과, 폴리에틸렌 글리콜 침전, 크로마토그래피 및 면역자성 비드 분리를 포함한 기타 분리 방법이 개발되었습니다⁵. EV 치료제의 임상 번역 및 상용화를 제한하는 현재 병목 현상은 EV의 확장성과 재현성이 높은 분리를 허용하는 분리 기술의 심각한 부족입니다 ^6,7,8. 기존의 EV 분리 기술(예: 초원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피)은 낮은 수율(1 x 10^7-1 x 10⁸/1 x 10 6 세포), 긴 생산 주기(24-48시간), 제품 품질의 낮은 재현성, EV에 대한 현재 임상 수요를 충족할 수 없는 고가의 에너지 집약적인 생산 장비가 필요합니다⁶.

네이티브 EV의 합성 대리물인 엑소좀 모방체(EM)는 매우 유사한 구조, 기능 및 생산 확장성으로 인해 중요한 주목을 받고 있습니다. EM의 주요 공급원은 연속 절편(^continuous sectioning)9,10을 가진 전체 부모 세포의 직접 압출에 의한 것으로, 네이티브 EV(native EV)^11,12로서 강력한 생물학적 기능을 보여준다. 예를 들어, 인간 탯줄 중간엽 줄기세포(hUCMSCs)에서 유래한 EM은 네이티브 EV와 유사한 상처 치유 효과를 발휘하며 단백질 구성이 더 풍부하다¹³. 전체 세포에서 파생된 EM은 EV의 생물학적 복잡성을 가지고 있지만 주요 단점은 다양한 세포 소기관과 세포 파편에 의해 필연적으로 오염되기 때문에 제품의 이질성입니다. 단백질 국소화 분석은 또한 전체 세포 압출에서 유래한 EM이 미토콘드리아와 소포체(endoplasmic reticulum)로부터 많은 비EV 특이적 단백질을 포함한다는 것을 밝혀냈다¹³. 더욱이, EM을 제조하는 대부분의 방법은 여전히 시간과 에너지가 많이 소요되는 공정인 초원심분리를 필요로 한다¹⁴. 엑소좀이 세포 엔도솜에서만 유래한다는 사실을 고려하여, 우리는 생체공학적 엔도솜 유래 나노소포가 전체 세포 압출 방법으로 생성된 잘 확립된 세포막 유래 EM과 비교하여 엑소좀과 EM 간의 생물학적 상동성을 더 잘 재현할 수 있다는 가설을 세웠^{습니다 14}. 그럼에도 불구하고 엔도솜 유래 나노 소포의 제조는 실행 가능한 접근 방식이 없기 때문에 어렵습니다.

다양한 질병 치료를 위한 무세포 치료제와 나노 단위의 약물 전달 시스템의 대용물로 EV를 활용하여 임상 연구가 수행되었습니다. 예를 들어, 골수 중간엽 줄기세포에서 유래한 EV는 COVID-19로 인한 중증 폐렴 치료에 사용되어 유망한 결과를 얻었습니다. 최근에는 CD24 단백질을 운반하는 유전자 조작 EV도 COVID-19 환자 치료에 강력한 치료 효과를 입증했습니다^15,16. 그러나 EV 요법의 임상적 요구 사항은 낮은 수율과 비용 때문에 전통적인 분리 방법으로는 여전히 충족할 수 없습니다. 이 연구는 자기 분리 보조 고속 균질화 접근 방식을 통한 엔도솜 유래 나노 소포의 대규모 생산을 보고합니다. MNP의 세포내이입 경로를 이용하여 자기 분리를 통해 MNP가 로드된 엔도솜을 분리한 다음 고속 균질화를 통해 엔도솜을 단분산 나노소포로 제형화합니다. 이 프로토콜에 의해 수집되는 엔도솜의 유형은 다양하기 때문에 업계에서 우수제조관리기준(GMP)을 확립하기 위해서는 여전히 심층적인 연구가 필요합니다. 이 새로운 EM 준비 접근 방식은 더 시간 효율적(고속 균질화 5분)하여 네이티브 EV와 상동적인 나노 소포를 얻을 수 있습니다. 초원심분리보다 동일한 양의 세포에서 기하급수적으로 더 많은 소포를 생성하며, 이는 일반적으로 다양한 세포 유형에 적용될 수 있습니다.

프로토콜

참고: 이 방법의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. EM 준비 및 격리

1. MNP의 세포 내재화
   1. 세포 배양
      1. 1 × 10⁶ 개의 쥐 골수 중간엽 줄기 세포(BMSC), 293T 세포 또는 마우스 난소 상피암 세포(ID8)를 6웰 플레이트당 2mL에 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 5% 페니실린-스트렙토마이신 용액(P/S)이 있는 DMEM 완전 배지에 현탁시킵니다( 재료 표 참조).
      2. 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 밤새 세포를 배양합니다.
         참고: 부착 후 세포의 수는 약 1 × 10⁶이었습니다.
   2. MNP의 세포내이입(Endocytosis)
      1. 각 6웰 플레이트의 중간 부피를 1mL로 줄입니다. 100μg/1 × 10⁶ 세포의 농도에서 10nm 폴리리신 변성 산화철 나노입자(IOLP)(재료 표 참조)와 세포를 공동 배양하고 37°C에서 5% CO2를 함유한 분위기에서₁₂시간 동안 배양하여 세포가 IONP를 완전히 내포할 수 있도록 합니다.
2. 엔도솜의 분리 및 균질화
   1. 세포 저긴장 치료
      1. IONP가 완전히 내재화된 세포를 0.5mL/웰 트립신으로 3분 동안 분해하고 1mL/웰 완전한 배지를 추가하여 분해를 종료합니다.
      2. 1000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 인산염 완충 식염수(PBS)와 원심분리기에 세포를 재현탁시키면서 잔류 배지와 흡수되지 않은 IONP를 씻어내기 위해 두 번 반복합니다.
      3. 마지막으로, 미리 준비된 하이포토닉 용액(71.4mM 염화칼륨, 1.3mM 구연산나트륨, pH 7.2-7.4)에 펠릿을 8mL에 15분 동안 재현탁시킵니다( 재료 표 참조).
   2. 저속 균질화에 의한 세포 기관 방출
      1. 저긴장성 용액의 세포 현탁액을 유리 시험관으로 옮기고 유리 균질화기( 재료 표 참조)를 사용하여 1000rpm에서 20회 충격하여 세포 기관을 방출합니다.
   3. 엔도솜을 얻기 위한 자기 분리
      1. 균질화된 세포 용액 1mL를 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 옮기고 자기 분리기에 1시간 동안 넣어 IONP가 로드된 엔도솜을 다른 소기관(예: 핵 및 미토콘드리아) 및 세포 파편에서 완전히 분리합니다.
      2. 마그네틱 프레임 옆에 있는 미세 원심분리기 튜브의 접촉면( 재료 표 참조), 즉 IONP가 로드된 엔도솜에 있는 갈색 펠릿을 수집합니다. 마이크로 원심분리 튜브에 있는 액체를 버리고 3mL의 PBS를 추가하여 엔도솜을 재현탁시킵니다.
3. 고속 균질화
   1. 엔도솜이 포함된 용액을 액체 부피가 3-10mL 사이인 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 고속 균질화기의 10mm 프로브( 재료 표 참조)를 바닥에 닿지 않고 원심분리기 튜브의 바닥까지 연장합니다. 화면 아래의 속도 버튼을 조정하고 속도를 140 x g 로 설정하고 시간 버튼을 조정하여 시간을 5분으로 설정한 다음 OK 버튼을 누릅니다.
   3. Start 버튼을 눌러 샘플 아래에 아이스박스를 놓은 후 균질화를 수행합니다.
4. EM을 위한 마그네틱 분류
   1. 고속 균질화에서 얻은 나노 소포가 포함된 용액을 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 옮기고 자기 분리기에 1시간 동안 넣습니다.
   2. 필요한 EM이 포함된 액체를 수집합니다. 자유 IONP 및 IONP 부하 EM을 흡착하는 마그네틱 프레임 옆의 튜브 표면을 만지지 않도록 주의하십시오.

2. EM 특성화(그림 2 및 그림 3)

1. 동적 광산란(DLS) 분석
   1. 벽을 따라 EM 시료 1mL(20μg/mL)를 큐벳에 주입하고 DLS 기기의 기기 시료 슬롯에 넣습니다( 재료 표 참조).
   2. DLS 소프트웨어를 열고 입자 크기 테스트를 선택한 다음 테스트를 시작합니다.
   3. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다( 재료 표 참조).
2. 나노 입자 추적 분석(NTA)
   1. PBS로 EM을 1 ×^{10 7-1} × 10⁸ 입자/mL의 용액에 희석하고 500-1000μL/분의 유속으로 1mL 주사기를 사용하여 NTA 기기의 챔버( 재료 표 참조)에 주입합니다.
   2. 488개의 레이저 채널을 열고 소프트웨어 인터페이스의 EM 수가 100-300개 이내이고 브라운 모션인지 확인합니다.
   3. 제조업체의 프로토콜에 따라 적절한 SOP(EV-488)를 선택하여 기기의 감도가 EM 감지에 적합한지 확인하십시오.
3. 투과 전자 현미경 (TEM)
   1. EM(1mg/mL)을 5% 글루타르알데히드의 동일한 부피로 30분 동안 고정하고 BCA 단백질 분석 키트로 EM의 농도를 1mg/mL로 정량화합니다.
   2. 구리 메쉬의 탄소 쪽에 EM을 10μL 방울 떨어뜨리고 10분 후 여과지로 측면에서 과도한 액체를 제거합니다. PBS 10μL를 넣고 여과지로 즉시 블라이트합니다. 과도한 글루타르알데히드를 제거하기 위해 두 번 반복합니다.
   3. 5μL의 우라닐 아세테이트 조영제를 떨어뜨리고 1분 동안 음의 염색을 한 다음 여분의 조영제를 제거합니다. 탈이온수로 3회 세척하고 실온(RT)에서 건조시킵니다.
   4. 100kV의 가속 전압에서 TEM으로 이미지를 기록합니다.
4. 웨스턴 블로팅
   1. 100μL의 세포 용해 완충액과 5μL의 50x 프로테아제 억제제 칵테일을 샘플에 추가합니다( 재료 표 참조). 피펫 건으로 부드럽게 섞고 얼음에 30분 동안 넣습니다.
   2. 용액을 1000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 BCA 단백질 분석 키트로 상층액의 단백질 농도를 정량화하여 수집합니다.
   3. 100μL 상층액을 25μL의 5x 단백질 로딩 버퍼와 혼합하고 95°C에서 10분 동안 가열합니다.
   4. 미리 형성된 겔의 지침에 따라 겔을 준비합니다. 웰당 15μg의 단백질을 로드하고 80V에서 겔 전기영동으로 실행합니다. 샘플이 분리 겔로 이동할 때까지 기다렸다가 100V로 변경한 다음 단백질을 얼음 수조에서 60분 동안 100V의 니트로셀룰로오스 막으로 옮깁니다.
   5. 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 비EV 특이적 마커(Calnexin) 및 EV 바이오마커(Annexin 및 CD63)를 검출합니다( 재료 표 참조).
      참고: 항체는 제조업체의 권장 사항에 따라 희석됩니다.

3. In vitro EM 기능 검출

1. EM 라벨링
   1. PKH26 1μL와 희석제 C 250μL(1:250)를 혼합하여 2x 염색 용액(4 × ^10-6M )을 만듭니다( 재료 표 참조).
   2. 250μL의 EM(1mg/mL)을 250μL의 2x 염색 용액과 혼합하고 피펫팅 건으로 빠르게 불어냅니다.
   3. 원심분리기 튜브를 부드럽게 뒤집으면서 2-5분 동안 상온에서 배양합니다.
   4. 동일한 양의 혈청 또는 1% 소 혈청 단백질을 추가하고 1분 동안 배양하여 소화를 종료합니다.
   5. 30분 동안 3000 x g 에서 1000 KD 한외여과 튜브로 한외여과를 통해 과도한 PKH26을 제거하고 PBS를 추가하여 3회 반복합니다. PBS를 사용하여 남은 액체를 500μL로 재현탁하고 0.22μm 필터를 통해 여과합니다.
2. 세포 흡수 분석
   1. 세포 접종 : 10 % FBS 및 5 % P / S를 함유 한 1mL의 DMEM을 함유 한 35mm 공초점 접시에 1 × 10⁶ 세포를 종자하고 37 °C 및 5 % CO₂ 에서 밤새 배양합니다.
   2. 0.22μm 멸균 주사기 필터로 EM을 필터링하여 잠재적인 오염을 제거합니다.
   3. 세포를 PKH26 표지 EM(10-9입자/mL)으로 8시간 동안 처리합니다.
   4. PBS로 3회 세척하고 DAPI(10ng/mL)를 넣고 RT에서 10분간 배양합니다.
   5. 405nm 및 561nm 레이저 채널을 사용하여 컨포칼 레이저 스캐닝 형광 현미경 검사에서 형광 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조).

결과

자기 분리 보조 고속 균질화에 의한 EM 준비의 작업 흐름은 그림 1에 나와 있습니다. 세포는 10nm 폴리리신 변형 IONP를 내재화하며, 이는 세포내이입(endocytosis)을 통해 엔도솜에 특이적으로 축적됩니다(그림 3A). 저긴장성 완충액으로 처리하고 균질화한 후, IONP가 로드된 엔도솜을 세포에서 방출하고 이어서 자기 분리에 의해 수집합니다. 분리된 엔도솜은 ?...

토론

무세포 치료제 및 나노 단위 약물 전달 시스템의 대체물인 EV는 아직 임상적 기대치를 충족하지 못했으며, 주요 장애물은 확장 가능하고 재현 가능한 생산 및 정제 방법이 부족하다는 것입니다⁶. 따라서 다양한 유형의 EM이 유사한 생물학적 복잡성을 가진 EV 유사체로 개발되었습니다¹⁴. 현재까지 가장 일반적으로 사용되는 EM의 예는 세포 원형질막 유래 나노소포...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin antibody	ABclonal	A11235	Western blotting
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Calnexin	GeneTex	HL1598	Western blotting
CD63 antibody	ABclonal	A19023	Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP	Beyotime	P0013	Western blotting
Centrifuge	Beckman	Allegra X-30R	Cell centrifuge
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	NIKON	A1 HD25	Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)	GIBCO	C11995500BT	Cell culture
Dynamic light scattering (DLS)	Malvern	Zetasizer Nano ZS ZEN3600	Diameter analysis
Electric glass homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	DY89-II	Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS	system Bioscience	EXO-FBS-50A-1	Cell culture
High-speed homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	XHF-DY	High-speed homogenization
Magnetic grate	Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)	NA	Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT	The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag1100-10	Cell culture
Potassium chloride	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail	Beyotime	P1030	Proteinase inhibitor
Sodium citrate	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100plus	Morphology image
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers	Particle Metrix	PMX120	Nanoparticle tracking analysis