שיטת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של שלפוחיות שמקורן באנדוזום

Summary

במאמר זה אנו מתארים שיטת הומוגניזציה מהירה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) החולקים את אותו מקור ביולוגי ומבנה, מורפולוגיה והרכב חלבונים דומים של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות (EV).

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) משכו תשומת לב משמעותית במחקר פיזיולוגי ופתולוגי, אבחון מחלות וטיפול; עם זאת, התרגום הקליני שלהם הוגבל על ידי היעדר גישות ייצור בקנה מידה גדול. לכן, פרוטוקול זה מספק שיטת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) הנגזר מהאנדוזומים, שיש להם תפוקה גבוהה פי 100 בערך משיטת אולטרה-צנטריפוגה קונבנציונלית. בשיטה זו, ננו-חלקיקים מגנטיים (MNPs) הופנמו על ידי תאי ההורים באמצעות אנדוציטוזה ולאחר מכן הצטברו בתוך האנדוזומים שלהם. לאחר מכן, אנדוזומים עמוסי MNPs נאספו וטוהרו על ידי טיפול היפוטוני והפרדה מגנטית. הומוגנייזר במהירות גבוהה שימש לפירוק אנדוזומים טעוני MNP לננו-שלפוחיות חד-פיזוריות. השלפוחיות שמקורן באנדוזום המתקבלות הן בעלות אותו מקור ביולוגי ומבנה, ומאופיינות בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת וכתם מערבי. המורפולוגיה והרכב החלבונים שלהם דומים לרכבים חשמליים מקומיים, מה שמצביע על כך ש- EMs עשויים לשמש כתחליף בעלות נמוכה ובתפוקה גבוהה של כלי רכב חשמליים מקוריים לתרגומים קליניים.

Introduction

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן שלפוחיות קטנות המופרשות כמעט על ידי כל התאים בטווח גדלים של 30-150 ננומטר, המכילות שפע של חומרים ביו-אקטיביים. בהתאם לתא המוצא, כלי רכב חשמליים מראים הטרוגניות גבוהה, בעלי רכיבים מרובים ספציפיים לתאי אב¹. כלי רכב חשמליים משתחררים לנוזלי הגוף ומועברים לאתרים מרוחקים, שם הם נלקחים על ידי תאי מטרה לפעולה², אשר ניתן להשתמש בהם כדי לספק מגוון רחב של מולקולות ביו-אקטיביות ותרופות לתיקון רקמות, אבחון וטיפול בגידולים ומודולציה חיסונית ^3,4. עם זאת, ננו-חלקיקים ביולוגיים אחרים (למשל, ליפופרוטאינים) וננו-שלפוחיות (למשל, כלי רכב חשמליים שמקורם במסלולים שאינם אנדוזומליים) בעלי תכונות ביופיזיקליות דומות בנוזלי גוף משפיעים באופן בלתי נמנע על בידוד וטיהור רכב חשמלי. נכון להיום, אולטרה-צנטריפוגה נותרה תקן הזהב לבידוד רכב חשמלי, ושיטות בידוד אחרות, כולל צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז, אולטרה-סינון, משקעים מפוליאתילן גליקול, כרומטוגרפיה ובידוד חרוזים אימונומגנטי, פותחו⁵. צוואר הבקבוק הנוכחי המגביל את התרגום הקליני והמסחור של טיפולים ברכב חשמלי הוא המחסור החמור בטכניקות בידוד המאפשרות בידוד מדרגי וניתן לשחזור של כלי רכב חשמליים ^6,7,8. טכניקות בידוד מסורתיות של כלי רכב חשמליים (למשל, צנטריפוגה אולטרה-צנטריפוגית וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל) סובלות מתפוקות נמוכות (1 x 10^7-1 x 10⁸/1 x 10⁶ תאים), מחזור ייצור ארוך (24-48 שעות), יכולת שחזור ירודה של איכות המוצר, ודורשות ציוד ייצור יקר ועתיר אנרגיה שאינו יכול לענות על הביקוש הקליני הנוכחי לרכבים חשמליים⁶.

חיקויים אקסוזומיים (EMs), פונדקאיות סינתטיות של כלי רכב חשמליים מקומיים, משכו תשומת לב חשובה בשל המבנה, התפקוד והמדרגיות הדומים מאוד שלהם בייצור. המקור העיקרי של EMs הוא מהאקסטרוזיה הישירה של תאי הורים שלמים עם חתך רציף^9,10, המדגים פונקציות ביולוגיות חזקות כמו EVs מקומיים^11,12. לדוגמה, EMs שמקורם בתאי גזע מזנכימליים של חבל הטבור האנושי (hUCMSCs) מפעילים השפעות ריפוי פצעים דומות לאלה של כלי רכב חשמליים מקומיים, והם עשירים יותר בהרכב חלבונים¹³. למרות EMs נגזר תאים שלמים יש את המורכבות הביולוגית של EVs, החיסרון העיקרי שלהם הוא ההטרוגניות של מוצרים כי הם מזוהמים באופן בלתי נמנע על ידי אברונים תאיים שונים פסולת התא. ניתוח לוקליזציה של חלבונים גילה עוד כי EMs שמקורם באקסטרוזיה של תאים שלמים מכילים חלבונים רבים שאינם ספציפיים ל- EVs מהמיטוכונדריה ומהרשתית האנדופלסמית¹³. יתר על כן, רוב השיטות לייצור EMs עדיין דורשים אולטרה-צנטריפוגה, תהליך גוזל זמן רב ואנרגיה¹⁴. בהתחשב בעובדה שאקסוזומים נגזרים באופן בלעדי מאנדוזומים תאיים, שיערנו כי ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים מהונדסים ביולוגית עשויות לשחזר טוב יותר את ההומולוגיה הביולוגית בין אקסוזומים ו- EMs בהשוואה ל- EMs המבוססים היטב שמקורם בקרום התא המיוצרים בשיטת אקסטרוזיה של תאים שלמים¹⁴. עם זאת, הייצור של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזום קשה בשל היעדר גישות בנות קיימא.

מחקרים קליניים בוצעו על ידי שימוש ברכבים חשמליים כתחליף לטיפול ללא תאים ומערכת אספקת תרופות ננומטרית לטיפול במחלות שונות. לדוגמה, כלי רכב חשמליים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים ממח עצם שימשו לטיפול בדלקת ריאות חמורה שנגרמה על ידי COVID-19 והשיגו תוצאות מבטיחות. לאחרונה, כלי רכב חשמליים מהונדסים גנטית הנושאים חלבוני CD24 הוכיחו גם יתרונות טיפוליים רבי עוצמה לטיפול בחולי COVID-19^15,16. עם זאת, הדרישה הקלינית של טיפול ברכב חשמלי עדיין לא יכולה להיענות בשיטות בידוד מסורתיות בגלל התשואה והעלות הנמוכות. מחקר זה מדווח על ייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזום באמצעות גישת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית. הוא מנצל את מסלול האנדוציטוזה של MNPs כדי לבודד אנדוזומים טעוני MNP באמצעות הפרדה מגנטית, ולאחר מכן הומוגניזציה במהירות גבוהה כדי לנסח אנדוזומים לננו-שלפוחיות חד-פיזור. מכיוון שסוגי האנדוזומים הנאספים על ידי פרוטוקול זה מגוונים, עדיין נדרש מחקר מעמיק נוסף כדי לבסס שיטות ייצור נאותות (GMP) בתעשייה. גישה חדשנית זו להכנת EM יעילה יותר בזמן (5 דקות של הומוגניזציה במהירות גבוהה) כדי להשיג ננו-שלפוחיות הומולוגיות לרכבים חשמליים מקומיים. הוא מייצר באופן אקספוננציאלי יותר שלפוחיות מאותן כמויות של תאים מאשר אולטרה-צנטריפוגה, אשר ניתן ליישם בדרך כלל על סוגי תאים שונים.

Protocol

הערה: סכמה של השיטה מוצגת באיור 1.

1. הכנה ובידוד EM

1. הפנמת תאים של MNPs
   1. תרבית תאים
      1. השהה 1 × 10⁶ תאי גזע מזנכימליים של מח עצם חולדה (BMSC), 293T או תאי סרטן אפיתל של שחלות עכבר (ID8) ב- DMEM בינוני מלא עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו- 5% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (P / S) ב -2 מ"ל לכל צלחת שש בארות (ראה טבלת חומרים).
      2. תרבית את התאים לילה ב 37 ° C ו 5% CO₂.
         הערה: מספר התאים לאחר ההיצמדות היה בערך 1 × 10⁶.
   2. אנדוציטוזה של MNPs
      1. הפחת את נפח בינוני של כל צלחת שש בארות ל 1 מ"ל. תרבית משותפת של התאים עם ננו-חלקיקים של תחמוצת ברזל מהונדסת פוליליזין (IONPs) (ראו טבלת חומרים) בריכוז של 100 מיקרוגרם/1 × 10⁶ תאים ודגרה ב-37°C באטמוספירה המכילה 5% CO₂ למשך 12 שעות כדי לאפשר לתאים אנדוציטוזה IONPs באופן מלא.
2. בידוד והומוגניזציה של אנדוזומים
   1. טיפול היפוטוני בתאים
      1. לעכל את התאים שהפנימו IONPs באופן מלא עם 0.5 מ"ל / טוב טריפסין במשך 3 דקות, ולסיים את העיכול על ידי הוספת 1 מ"ל / טוב מדיום שלם.
      2. צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 5 דקות, ולזרוק את supernatant. השהה מחדש את התאים במי מלח חיץ פוספט (PBS) ובצנטריפוגה, פעמיים שוב ושוב כדי לשטוף את שאריות התווך והבלתי נספגות.
      3. לבסוף, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-8 מ"ל בתמיסה היפוטונית מוכנה מראש (71.4 מ"מ אשלגן כלורי, 1.3 מ"מ נתרן ציטראט, pH 7.2-7.4) למשך 15 דקות (ראה טבלת חומרים).
   2. שחרור אברונים על ידי הומוגניזציה במהירות נמוכה
      1. מעבירים את מתלה התא בתמיסה היפוטונית למבחנה מזכוכית ומשחררים את האברונים באמצעות הומוגנייזר זכוכית (ראו טבלת חומרים) ב-20 זעזועים ב-1000 סל"ד.
   3. הפרדה מגנטית להשגת אנדוזומים
      1. העבירו 1 מ"ל של תמיסת התא ההומוגנית לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל והניחו במפריד מגנטי למשך שעה אחת כדי להפריד באופן מלא אנדוזומים טעוני IONP מאברונים אחרים (כגון גרעין ומיטוכונדריה) ומפסולת תאים.
      2. אספו את הכדוריות החומות על משטח המגע של צינורות המיקרוצנטריפוגות ליד המסגרת המגנטית (ראו טבלת חומרים), כלומר אנדוזומים טעוני IONP. השליכו את הנוזל לצינורות המיקרוצנטריפוגות והוסיפו 3 מ"ל PBS כדי להשעות מחדש את האנדוזומים.
3. הומוגניזציה במהירות גבוהה
   1. מעבירים את התמיסה המכילה את האנדוזומים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל עם נפח נוזלי בין 3-10 מ"ל.
   2. הרחב את הגשושית בקוטר 10 מ"מ של ההומוגנייזר המהיר (ראה טבלת חומרים) לתחתית צינור הצנטריפוגה מבלי לגעת בתחתית. התאם את לחצן המהירות מתחת למסך, הגדר את המהירות ל -140 x g וכוונן את לחצן הזמן כדי להגדיר את הזמן של 5 דקות, ולאחר מכן לחץ על הלחצן אישור .
   3. לחץ על לחצן התחל כדי לבצע את ההומוגניזציה לאחר הנחת קופסת קרח מתחת לדגימה.
4. מיון מגנטי עבור EMs
   1. להעביר את הפתרון המכיל nanovesicles המתקבל הומוגניזציה במהירות גבוהה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ולשים אותו במפריד מגנטי במשך 1 שעות.
   2. אסוף את הנוזל המכיל את ה- EMs הנדרשים. היזהר לא לגעת בפני השטח של הצינורות הסמוכים למסגרת המגנטית, אשר ספחה IONPs חופשיים ו- EMs טעונים IONP.

2. אפיון EM (איור 2 ואיור 3)

1. ניתוח פיזור אור דינמי (DLS)
   1. הזריקו 1 מ"ל של דגימת EMs (20 מיקרוגרם/מ"ל) לאורך הקיר לתוך הקובטה והניחו אותה בחריץ דגימת המכשיר של מכשיר ה-DLS (ראו טבלת חומרים).
   2. פתח את תוכנת DLS, בחר בדיקת גודל חלקיקים והתחל בבדיקה.
   3. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA (ראה טבלת חומרים).
2. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)
   1. לדלל EMs עם PBS לתמיסה ב 1 × 10^{7-1 ×} 10⁸ חלקיקים / מ"ל ולהזריק אותם לתוך התא של מכשיר נת"ע (ראה טבלת חומרים) באמצעות מזרק 1 מ"ל בקצב זרימה של 500-1000 מיקרוליטר / דקה.
   2. פתח את 488 ערוצי הלייזר וודא שמספר ה- EMs בממשק התוכנה הוא בטווח של 100-300 ובתנועה בראונית.
   3. בהתאם לפרוטוקול היצרן, בחר את ה- SOP המתאים (EV-488) כדי להבטיח שרגישות המכשיר מתאימה לזיהוי EM.
3. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)
   1. תקן EMs (1 מ"ג / מ"ל) עם נפח שווה של 5% גלוטראלדהיד למשך 30 דקות, וכמת את ריכוז EMs כ- 1 מ"ג / מ"ל על ידי ערכת בדיקת חלבון BCA.
   2. הניחו טיפה של 10 μL של EMs בצד הפחמן של רשת הנחושת, והסירו נוזלים עודפים מהצד עם נייר סינון לאחר 10 דקות. הוסף 10 μL של PBS וכתם מיד עם נייר סינון. יש לחזור על הפעולה פעמיים כדי להסיר עודפי גלוטראלדהיד.
   3. יש לטפטף 5 μL של חומר ניגוד אורניל אצטט ולהכתים באופן שלילי למשך דקה אחת, ולאחר מכן להסיר את חומר הניגוד העודף. יש לשטוף שלוש פעמים במים נטולי יונים, ולייבש בטמפרטורת החדר (RT).
   4. הקלט תמונה על ידי TEM במתח תאוצה של 100 kV.
4. כתם מערבי
   1. הוסף 100 μL של חיץ ליזה התא ו 5 μL של קוקטייל מעכבי פרוטאז 50x לדגימות (ראה טבלה של חומרים). מערבבים בעדינות עם אקדח פיפטה ומניחים על קרח למשך 30 דקות.
   2. צנטריפוגה את התמיסה ב 1000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, לכמת את ריכוז החלבון של supernatant עם ערכת בדיקת חלבון BCA, ולאסוף אותו.
   3. ערבבו את הסופרנאטנט בנפח 100 מיקרוליטר עם 25 מיקרוליטר של מאגר העמסת חלבון פי 5 וחממו בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות.
   4. הכינו ג'לים על פי הוראות הג'לים המוכנים. לטעון 15 מיקרוגרם של חלבון לכל באר ולהפעיל על ידי אלקטרופורזה ג'ל ב 80 V. לחכות הדגימה לרוץ לג'ל ההפרדה, לשנות ל 100 V, ולאחר מכן להעביר את החלבון לקרום nitrocellulose ב 100 V, 60 דקות תחת אמבט קרח.
   5. זהה את הסמנים שאינם ספציפיים לרכב חשמלי (Calnexin) ואת הסמנים הביולוגיים של EV (Annexin ו- CD63) על ידי כתמים מערביים (ראה טבלת חומרים).
      הערה: הנוגדנים מדוללים בהתאם להמלצות היצרן.

3. זיהוי פונקציית EM חוץ גופית

1. תיוג EMs
   1. ערבבו 1 μL של PKH26 עם 250 μL של מדלל C (1:250) ליצירת תמיסת צביעה 2x (4 × ^10-6 M) (ראו טבלת חומרים).
   2. מערבבים 250 μL של EMs (1 מ"ג / מ"ל) עם 250 μL של תמיסת צביעה 2x ונושפים במהירות עם אקדח פיפטינג.
   3. יש לדגור ב-RT למשך 2-5 דקות תוך היפוך עדין של צינור הצנטריפוגה.
   4. הוסיפו נפח שווה של סרום או 1% חלבון בסרום בקר ודגרו במשך דקה אחת כדי לסיים את העיכול.
   5. הסר עודפי PKH26 על ידי אולטרה-סינון עם צינורות אולטרה-סינון של 1000 KD ב-3000 x גרם למשך 30 דקות, וחזור על הפעולה שלוש פעמים על-ידי הוספת PBS. יש להשהות מחדש את הנוזל שנותר ל-500 מיקרוליטר עם PBS ולסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.
2. בדיקת ספיגת תאים
   1. חיסון תאים: זרע 1 × 10⁶ תאים בצלחות קונפוקליות 35 מ"מ עם 1 מ"ל DMEM המכיל 10% FBS ו 5% P / S, ודגרה ב 37 ° C ו 5% CO₂ לילה.
   2. סנן את ה- EMs עם מסנני מזרק סטריליים 0.22 מיקרומטר כדי להסיר זיהום פוטנציאלי.
   3. טפל בתאים עם EMs המסומנים ב- PKH26 (10 9 חלקיקים / מ"ל) במשך 8 שעות.
   4. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS, להוסיף DAPI (10 ננוגרם/מ"ל) ולדגור במשך 10 דקות ב-RT.
   5. קבל את התמונות הפלואורסצנטיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי לסריקת לייזר קונפוקלית באמצעות תעלות לייזר של 405 ננומטר ו- 561 ננומטר (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

זרימת העבודה של הכנת EM על-ידי הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית מוצגת באיור 1. תאים מפנימים IONPs מהונדסים בפוליליזין בגודל 10 ננומטר, אשר מצטברים באופן ספציפי באנדוזומים באמצעות אנדוציטוזה (איור 3A). לאחר שטופלו בחיץ היפוטוני והומוגני, האנדוזומים ט?...

Discussion

כפונדקאית של טיפול ללא תאים ומערכת אספקת תרופות בקנה מידה ננומטרי, כלי רכב חשמליים עדיין לא עמדו בציפיות הקליניות שלהם, ומכשול עיקרי הוא היעדר שיטות ייצור וטיהור ניתנות להרחבה ולשחזור⁶. לכן, סוגים שונים של EMs פותחו כאנלוגים EV עם מורכבות ביולוגית דומה¹⁴. נכון להיום, ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin antibody	ABclonal	A11235	Western blotting
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Calnexin	GeneTex	HL1598	Western blotting
CD63 antibody	ABclonal	A19023	Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP	Beyotime	P0013	Western blotting
Centrifuge	Beckman	Allegra X-30R	Cell centrifuge
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	NIKON	A1 HD25	Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)	GIBCO	C11995500BT	Cell culture
Dynamic light scattering (DLS)	Malvern	Zetasizer Nano ZS ZEN3600	Diameter analysis
Electric glass homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	DY89-II	Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS	system Bioscience	EXO-FBS-50A-1	Cell culture
High-speed homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	XHF-DY	High-speed homogenization
Magnetic grate	Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)	NA	Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT	The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag1100-10	Cell culture
Potassium chloride	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail	Beyotime	P1030	Proteinase inhibitor
Sodium citrate	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100plus	Morphology image
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers	Particle Metrix	PMX120	Nanoparticle tracking analysis