АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы описываем метод высокоскоростной гомогенизации с помощью магнитной сепарации для крупномасштабного производства нановезикул, полученных из эндосом, как нового типа имитаторов экзосом (ЭМ), которые имеют то же биологическое происхождение и сходную структуру, морфологию и белковый состав нативных внеклеточных везикул (ВВ).

Аннотация

Внеклеточные везикулы (ВВ) привлекли значительное внимание в физиологических и патологических исследованиях, диагностике и лечении заболеваний; Тем не менее, их клиническая трансляция была ограничена отсутствием подходов к масштабному производству. Таким образом, этот протокол обеспечивает высокоскоростной метод гомогенизации с помощью магнитной сепарации для крупномасштабного производства нановезикул, полученных из эндосом, в качестве нового типа имитаторов экзосом (ЭМ), полученных из эндосом, которые имеют примерно в 100 раз более высокий выход, чем традиционный метод ультрацентрифугирования. В этом методе магнитные наночастицы (MNP) интернализировались родительскими клетками посредством эндоцитоза и впоследствии накапливались в их эндосомах. Затем были собраны эндосомы с MNP, загруженные MNP, и очищены с помощью гипотонической обработки и магнитной сепарации. Высокоскоростной гомогенизатор был использован для разбиения эндосом, загруженных MNP, на монодисперсные нановезикулы. Полученные везикулы, полученные из эндосом, имеют одинаковое биологическое происхождение и структуру, характеризуются анализом отслеживания наночастиц, просвечивающим электронным микроскопом и вестерн-блоттингом. Их морфология и белковый состав аналогичны нативным ВВ, что указывает на то, что ЭМ потенциально могут служить недорогим и высокопродуктивным суррогатом нативных ВВ для клинических трансляций.

Введение

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой небольшие везикулы, секретируемые почти всеми клетками с диапазоном размеров 30-150 нм, содержащие большое количество биологически активных веществ. В зависимости от исходной клетки ВВ демонстрируют высокую гетерогенность, обладая несколькими компонентами, специфичными для родительских клеток1. ВВ высвобождаются в жидкости организма и транспортируются в отдаленные участки, где они поглощаются клетками-мишенями для действия2, которое может быть использовано для доставки широкого спектра биологически активных молекул и лекарств для восстановления тканей, диагностики и лечения опухолей, а также иммуномодуляции 3,4. Однако другие биологические наночастицы (например, липопротеины) и нановезикулы (например, ВВ, полученные из неэндосомальных путей) с аналогичными биофизическими свойствами в жидкостях организма неизбежно влияют на выделение и очистку ВВ. На сегодняшний день ультрацентрифугирование остается золотым стандартом для изоляции ВВ, ибыли разработаны другие методы изоляции, включая центрифугирование с градиентом плотности сахарозы, ультрафильтрацию, осаждение полиэтиленгликоля, хроматографию и иммуномагнитную изоляцию шариков. В настоящее время узким местом, ограничивающим клиническую трансляцию и коммерциализацию терапевтических средств для лечения ВВ, является острая нехватка методов выделения, которые позволяют обеспечить высокомасштабируемую и воспроизводимую изоляцию ВВ 6,7,8. Традиционные методы выделения ВВ (например, ультрацентрифугирование и эксклюзионная хроматография) страдают от низкого выхода (1 x 107-1 x 108/1 x 106 клеток), длительного производственного цикла (24-48 ч), плохой воспроизводимости качества продукции и требуют дорогостоящего и энергоемкого производственного оборудования, которое не может удовлетворить текущий клинический спрос на электромобили6.

Имитаторы экзосом (ЭМ), синтетические суррогаты нативных электромобилей, привлекли важное внимание из-за их очень похожей структуры, функций и масштабируемости в производстве. Основным источником ЭМ является прямая экструзия целых родительских клеток с непрерывным секционированием9,10, демонстрирующая мощные биологические функции нативных ВВ11,12. Например, ЭМ, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (hUCMSCs), оказывают такое же ранозаживляющее действие, как и нативные ВВ, и более богаты белковым составом13. Несмотря на то, что ЭМ, полученные из цельных клеток, имеют биологическую сложность ВВ, их основным недостатком является гетерогенность продуктов, поскольку они неизбежно загрязняются различными клеточными органеллами и клеточным мусором. Анализ локализации белков также показал, что ЭМ, полученные в результате экструзии цельных клеток, содержат много неспецифичных для ВВ белков из митохондрий и эндоплазматического ретикулума13. Кроме того, большинство методов производства ЭМ по-прежнему требуют ультрацентрифугирования, что является очень трудоемким и энергоемкимпроцессом14. Принимая во внимание тот факт, что экзосомы происходят исключительно из клеточных эндосом, мы предположили, что биоинженерные нановезикулы, полученные из эндосом, могут лучше повторять биологическую гомологию между экзосомами и ЭМ по сравнению с хорошо зарекомендовавшими себя ЭМ, полученными из клеточных мембран, полученными методом экструзии цельных клеток14. Тем не менее, производство нановезикул, полученных из эндосом, затруднено из-за отсутствия жизнеспособных подходов.

Клинические исследования проводились с использованием ВВ в качестве суррогата бесклеточной терапии и наноразмерной системы доставки лекарств для лечения различных заболеваний. Например, ВВ, полученные из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, использовались для лечения тяжелой пневмонии, вызванной COVID-19, и достигли многообещающих результатов. Недавно генетически модифицированные электромобили, несущие белки CD24, также продемонстрировали мощные терапевтические преимущества для лечения пациентов с COVID-1915,16. Тем не менее, клинические требования к терапии ВВ все еще не могут быть удовлетворены традиционными методами изоляции из-за низкой производительности и стоимости. В этом исследовании сообщается о крупномасштабном производстве нановезикул, полученных из эндосом, с помощью высокоскоростной гомогенизации с помощью магнитной сепарации. Он использует эндоцитозный путь MNP для выделения эндосом, загруженных MNP, с помощью магнитной сепарации с последующей высокоскоростной гомогенизацией для формирования эндосом в монодисперсные нановезикулы. Поскольку типы эндосом, собранных в рамках этого протокола, разнообразны, все еще необходимы дальнейшие углубленные исследования для установления надлежащей производственной практики (GMP) в отрасли. Этот новый подход к ЭМ-подготовке является более эффективным по времени (5 минут высокоскоростной гомогенизации) для получения нановезикул, гомологичных нативным ВВ. Он производит экспоненциально больше везикул из тех же количеств клеток, чем ультрацентрифугирование, которое в целом может быть применено к различным типам клеток.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема метода показана на рисунке 1.

1. Подготовка и изоляция ЭМ

  1. Клеточная интернализация MNP
    1. Клеточная культура
      1. Суспендировать 1 × 106 мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крысы (BMSC), 293Т-клеток или клеток эпителиального рака яичников мыши (ID8) в полной среде DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 5% раствором пенициллина-стрептомицина (P/S) по 2 мл на шестилуночный планшет (см. таблицу материалов).
      2. Культивируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток после адгезии составляло примерно 1 × 106.
    2. Эндоцитоз МНП
      1. Уменьшите средний объем каждой шестилуночной чашки до 1 мл. Совместное культивирование клеток с 10 нм модифицированными полилизин-модифицированными наночастицами оксида железа (ИОНФ) (см. таблицу материалов) в концентрации 100 мкг/1 × 106 клеток и инкубируют при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение12 ч, чтобы позволить клеткам полностью эндоцитозировать ИОНы.
  2. Выделение и гомогенизация эндосом
    1. Лечение клеточной гипотоники
      1. Переваривают клетки, которые полностью интернализировали ИОНПы, с помощью 0,5 мл/луночный трипсин в течение 3 мин и прекращают пищеварение, добавляя 1 мл/лунку полную среду.
      2. Центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в фосфатном солевом растворе (PBS) и центрифуге, многократно дважды, чтобы вымыть остаточную среду и неабсорбированные ионы.
      3. Наконец, повторно суспендировать гранулу в 8 мл в заранее приготовленном гипотоническом растворе (71,4 мМ хлорида калия, 1,3 мМ цитрата натрия, рН 7,2-7,4) в течение 15 мин (см. таблицу материалов).
    2. Высвобождение органелл путем низкоскоростной гомогенизации
      1. Переложите клеточную суспензию в гипотоническом растворе в стеклянную пробирку и выпустите органеллы с помощью стеклянного гомогенизатора (см. таблицу материалов) 20 ударами при 1000 об/мин.
    3. Магнитная сепарация для получения эндосом
      1. Перелейте 1 мл гомогенизированного клеточного раствора в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и поместите в магнитный сепаратор на 1 ч, чтобы полностью отделить эндосомы, загруженные IONP, от других органелл (таких как ядро и митохондрии) и клеточного мусора.
      2. Соберите коричневые гранулы на контактной поверхности пробирок микроцентрифуги рядом с магнитной рамкой (см. Таблицу материалов), т.е. эндосомами, загруженными IONP. Выбросьте жидкость в пробирки микроцентрифуги и добавьте 3 мл PBS для ресуспендирования эндосом.
  3. Высокоскоростная гомогенизация
    1. Перелейте раствор, содержащий эндосомы, в центрифужную пробирку объемом 15 мл с объемом жидкости от 3 до 10 мл.
    2. Выдвиньте зонд высокоскоростного гомогенизатора диаметром 10 мм (см. Таблицу материалов) на дно пробирки центрифуги, не касаясь дна. Отрегулируйте кнопку « Скорость » под экраном, установите скорость на 140 x g и отрегулируйте кнопку «Время », чтобы установить время 5 минут, затем нажмите кнопку OK .
    3. Нажмите кнопку «Пуск », чтобы выполнить гомогенизацию после помещения ящика со льдом под образец.
  4. Магнитная сортировка для ЭМ
    1. Раствор, содержащий нановезикулы, полученные в результате высокоскоростной гомогенизации, переносят в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл и помещают в магнитный сепаратор на 1 ч.
    2. Соберите жидкость, содержащую необходимые ЭМ. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться к поверхности трубок рядом с магнитной рамкой, которая адсорбирует свободные ИОНы и ЭМ, загруженные ИОНП.

2. Определение характеристик ЭМ (Рисунок 2 и Рисунок 3)

  1. Анализ динамического рассеяния света (DLS)
    1. Введите 1 мл образца ЭМ (20 мкг/мл) вдоль стенки в кювету и поместите его в слот для образца инструмента DLS (см. таблицу материалов).
    2. Откройте программное обеспечение DLS, выберите Particle Size Test (Тест размера частиц) и начните тестирование.
    3. Измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белка BCA (см. Таблицу материалов).
  2. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    1. Разбавляют ЭМ с ПБС до раствора со скоростью 1 × 107-1 × 108 частиц/мл и вводят их в камеру прибора НТА (см. таблицу материалов) с помощью шприца объемом 1 мл со скоростью потока 500-1000 мкл/мин.
    2. Откройте 488 лазерных каналов и убедитесь, что количество электромагнитных излучений в программном интерфейсе находится в пределах 100-300 и находится в броуновском движении.
    3. В соответствии с протоколом производителя выберите соответствующую СОП (EV-488), чтобы убедиться, что чувствительность прибора подходит для обнаружения электромагнитных излучений.
  3. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
    1. Фиксируйте ЭМ (1 мг/мл) с равным объемом 5% глутарового альдегида в течение 30 мин и количественно определяйте концентрацию ЭМ как 1 мг/мл с помощью набора для анализа белка BCA.
    2. Поместите каплю 10 мкл ЭМ на углеродную сторону медной сетки и удалите лишнюю жидкость со стороны фильтровальной бумаги через 10 минут. Добавьте 10 мкл PBS и сразу же промокните фильтровальной бумагой. Повторите дважды, чтобы удалить излишки глутарового альдегида.
    3. Капните 5 мкл контрастного вещества уранилацетата и окрашивайте в негативном виде в течение 1 минуты, затем удалите излишки контрастного вещества. Трижды промыть деионизированной водой и высушить при комнатной температуре (RT).
    4. Запись изображения с помощью ПЭМ при разгонном напряжении 100 кВ.
  4. Вестерн-блоттинг
    1. Добавьте к образцам 100 мкл буфера для лизиса клеток и 5 мкл коктейля из 50-кратных ингибиторов протеазы (см. таблицу материалов). Аккуратно перемешайте с помощью пистолета-пипетки и положите на лед на 30 минут.
    2. Центрифугируют раствор при 1000 x g в течение 10 мин при 4 °C, количественно определяют концентрацию белка надосадочной жидкости с помощью набора для анализа белка BCA и собирают его.
    3. Смешайте 100 мкл надосадочной жидкости с 25 мкл 5-кратного буфера для загрузки белка и нагревайте при 95 °C в течение 10 минут.
    4. Готовят гели в соответствии с инструкцией предварительно сформированных гелей. Загружают 15 мкг белка на лунку и проводят гель-электрофорезом при 80 В. Дождавшись, пока образец попадет в разделительный гель, измените на 100 В, а затем перенесите белок на нитроцеллюлозную мембрану при 100 В, 60 мин на ледяной бане.
    5. Определение неспецифичных для ВВ маркеров (Calnexin) и биомаркеров ВВ (Annexin и CD63) методом вестерн-блоттинга (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела разбавляются в соответствии с рекомендациями производителя.

3. Определение функции ЭМ in vitro

  1. Маркировка ЭМ
    1. Смешайте 1 мкл PKH26 с 250 мкл разбавителя C (1:250), чтобы получить 2-кратный раствор для окрашивания (4 × 10-6 M) (см. Таблицу материалов).
    2. Смешайте 250 мкл ЭМ (1 мг/мл) с 250 мкл 2-кратного раствора для окрашивания и быстро продуйте пистолетом для пипетирования.
    3. Инкубируйте при RT в течение 2-5 минут, осторожно переворачивая центрифужную пробирку.
    4. Добавьте равный объем сыворотки или 1% бычьего сывороточного белка и инкубируйте в течение 1 минуты, чтобы прекратить пищеварение.
    5. Удалите излишки PKH26 путем ультрафильтрации с помощью ультрафильтрационных трубок 1000 KD при 3000 x g в течение 30 мин и повторите три раза, добавив PBS. Ресуспендируйте оставшуюся жидкость до 500 мкл с помощью PBS и профильтруйте через фильтр 0,22 мкм.
  2. Анализ поглощения клеток
    1. Клеточная инокуляция: Высевают 1 × 106 клеток в конфокальные чашки диаметром 35 мм с 1 мл DMEM, содержащего 10% FBS и 5% P/S, и инкубируют при 37 °C и 5%CO2 в течение ночи.
    2. Отфильтруйте ЭМ стерильными шприцевыми фильтрами 0,22 мкм, чтобы удалить потенциальное загрязнение.
    3. Обрабатывайте клетки мечеными PKH26 ЭМ (10-9 частиц/мл) в течение 8 ч.
    4. Промыть три раза PBS, добавить DAPI (10 нг/мл) и инкубировать в течение 10 мин при RT.
    5. Получение флуоресцентных изображений в конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии с использованием лазерных каналов 405 нм и 561 нм (см. таблицу материалов).

Результаты

Рабочий процесс получения ЭМ методом высокоскоростной гомогенизации с помощью магнитной сепарации показан на рисунке 1. Клетки интернализируют 10-нм полилизин-модифицированные ионы, которые специфически накапливаются в эндосомах посредством эндоцитоза (ри...

Обсуждение

Являясь суррогатом бесклеточной терапии и наноразмерной системы доставки лекарств, ВВ еще не оправдали своих клинических ожиданий, и основным препятствием является отсутствие масштабируемых и воспроизводимыхметодов производства и очистки. Поэтому в качестве аналогов В...

Раскрытие информации

Д.В. и.Г. являются соавторами патентной заявки, поданной Институтом фундаментальной медицины и рака (IBMC) Китайской академии наук. Другой автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы признают использование приборов в Центре совместного использования контрольно-измерительных приборов в Институте фундаментальной медицины и рака (IBMC) Китайской академии наук. Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC; 82172598), Фондом естественных наук провинции Чжэцзян, Китай (LZ22H310001), Проектом 551 по подготовке кадров в области здравоохранения Комиссии по здравоохранению провинции Чжэцзян, Китай, Исследовательским проектом по сельскохозяйственному и социальному развитию Муниципального научно-технического бюро Ханчжоу (2022ZDSJ0474) и Междисциплинарным исследовательским грантом Цяньтан.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Annexin antibodyABclonalA11235Western blotting
BCA assay kitBeyotimeP0012Protein concentration assay
CalnexinGeneTexHL1598Western blotting
CD63 antibodyABclonalA19023Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IPBeyotimeP0013Western blotting
CentrifugeBeckmanAllegra X-30RCell centrifuge
CO2 incubatorThermoCell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopyNIKONA1 HD25Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)GIBCOC11995500BTCell culture
Dynamic light scattering (DLS)MalvernZetasizer Nano ZS ZEN3600Diameter analysis
Electric glass homogenizerSCIENTZ(Ningbo, China)DY89-IILow-speed homogenization
Exosome-depleted FBSsystem BioscienceEXO-FBS-50A-1Cell culture
High-speed homogenizerSCIENTZ(Ningbo, China)XHF-DYHigh-speed homogenization
Magnetic grateTuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)NAMagnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane LabelingSigma-AldrichPKH26GL-1KTThe kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)Mag1100-10Cell culture
Potassium chlorideAladdin7447-40-7Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktailBeyotimeP1030Proteinase inhibitor
Sodium citrateAladdin7447-40-7Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)JEOLJEM-2100plusMorphology image
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN-100Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzersParticle MetrixPMX120Nanoparticle tracking analysis

Ссылки

  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
  2. Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
  3. Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
  4. Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  5. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  6. Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  7. Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
  8. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
  9. Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
  10. Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
  11. Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
  12. Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
  13. Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
  14. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
  15. Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
  16. Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
  17. Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
  18. Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
  19. Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
  20. Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены