Un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de vesículas derivadas de endosomas

Resumen

Aquí, describimos un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas como un nuevo tipo de imitadores de exosomas (EM) que comparten el mismo origen biológico y una estructura, morfología y composición proteica similares de las vesículas extracelulares (EV) nativas.

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) han atraído una atención significativa en la investigación fisiológica y patológica, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades; Sin embargo, su traslación clínica se ha visto limitada por la falta de enfoques de fabricación a escala. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas como un nuevo tipo de imitadores de exosomas (EM) derivados de los endosomas, que tienen un rendimiento aproximadamente 100 veces mayor que el método de ultracentrifugación convencional. En este método, las nanopartículas magnéticas (MNP) fueron internalizadas por las células parentales a través de la endocitosis y posteriormente se acumularon dentro de sus endosomas. A continuación, se recogieron los endosomas cargados de MNPs y se purificaron mediante tratamiento hipotónico y separación magnética. Se utilizó un homogeneizador de alta velocidad para romper los endosomas cargados con MNP en nanovesículas monodispersas. Las vesículas derivadas del endosoma resultantes presentan el mismo origen biológico y estructura, caracterizadas por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el microscopio electrónico de transmisión y la transferencia occidental. Su morfología y composición proteica son similares a las de los VE nativos, lo que indica que los ME pueden servir potencialmente como un sustituto de bajo costo y alto rendimiento de los VE nativos para traducciones clínicas.

Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) son pequeñas vesículas secretadas por casi todas las células con un rango de tamaño de 30-150 nm, que contienen abundantes sustancias bioactivas. Dependiendo de la célula de origen, las VE muestran una alta heterogeneidad, poseyendo múltiples componentes específicos de las células parentales¹. Las VE se liberan en los fluidos corporales y se transportan a sitios distantes donde son absorbidas por las células diana para la acción², que se puede utilizar para administrar una amplia gama de moléculas bioactivas y fármacos para la reparación de tejidos, el diagnóstico y tratamiento de tumores y la modulación inmunitaria ^3,4. Sin embargo, otras nanopartículas biológicas (p. ej., lipoproteínas) y nanovesículas (p. ej., VE derivadas de vías no endosomales) con propiedades biofísicas similares en los fluidos corporales afectan inevitablemente al aislamiento y la purificación de las VE. Hasta la fecha, la ultracentrifugación sigue siendo el estándar de oro para el aislamiento de EV, y se han desarrollado otros métodos de aislamiento, incluida la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, la ultrafiltración, la precipitación de polietilenglicol, la cromatografía y el aislamiento inmunomagnético de perlas⁵. El cuello de botella actual que limita la traslación clínica y la comercialización de las terapias con VE es la grave falta de técnicas de aislamiento que permitan el aislamiento altamente escalable y reproducible de las VE ^6,7,8. Las técnicas tradicionales de aislamiento de VE (p. ej., ultracentrifugación y cromatografía de exclusión por tamaño) adolecen de bajo rendimiento (1 x 10^7-1 x 10⁸/1 x 10^{6 células}), largo ciclo de producción (24-48 h), escasa reproducibilidad de la calidad del producto y requieren equipos de producción caros y que consumen mucha energía y no pueden satisfacer la demanda clínica actual de VE⁶.

Los imitadores de exosomas (EM), sustitutos sintéticos de los EV nativos, han atraído una atención importante debido a su estructura, función y escalabilidad altamente similares en la producción. La principal fuente de EM proviene de la extrusión directa de células parentales enteras con seccionamiento continuo 9,10, demostrando potentes funciones biológicas como EV nativas^11,12. Por ejemplo, las ME derivadas de células madre mesenquimales del cordón umbilical humano (hUCMSC) ejercen efectos de cicatrización de heridas similares a los de las VE nativas y son más ricas en composición proteica¹³. Aunque los ME derivados de células enteras tienen la complejidad biológica de los VE, su principal inconveniente es la heterogeneidad de los productos, ya que están inevitablemente contaminados por varios orgánulos celulares y restos celulares. El análisis de localización de proteínas reveló además que las ME derivadas de la extrusión de células enteras contienen muchas proteínas no específicas de las VE de las mitocondrias y del retículo endoplásmico¹³. Además, la mayoría de los métodos de fabricación de EM siguen requiriendo la ultracentrifugación, un proceso que consume mucho tiempo y energía¹⁴. Teniendo en cuenta el hecho de que los exosomas se derivan exclusivamente de endosomas celulares, planteamos la hipótesis de que las nanovesículas derivadas de endosomas de bioingeniería pueden recapitular mejor la homología biológica entre exosomas y EM en comparación con los EM derivados de la membrana celular bien establecidos producidos por el método de extrusión de células completas¹⁴. Sin embargo, la fabricación de nanovesículas derivadas de endosomas es difícil debido a la falta de enfoques viables.

Se han llevado a cabo estudios clínicos utilizando VE como sustituto de la terapia libre de células y un sistema de administración de fármacos a nanoescala para el tratamiento de diversas enfermedades. Por ejemplo, las VE derivadas de células madre mesenquimales de la médula ósea se han utilizado para tratar la neumonía grave causada por la COVID-19 y han logrado resultados prometedores. Recientemente, los VE modificados genéticamente que transportan proteínas CD24 también han demostrado potentes beneficios terapéuticos para el tratamiento de pacientes con COVID-19^15,16. Sin embargo, el requisito clínico de la terapia EV aún no se puede cumplir con los métodos de aislamiento tradicionales debido al bajo rendimiento y costo. Este estudio informa de la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas a través de un enfoque de homogeneización de alta velocidad asistida por separación magnética. Aprovecha la vía de endocitosis de los MNP para aislar endosomas cargados de MNP mediante separación magnética, seguida de homogeneización de alta velocidad para formular endosomas en nanovesículas monodispersas. Dado que los tipos de endosomas recolectados por este protocolo son diversos, aún se requiere una investigación más profunda para establecer buenas prácticas de fabricación (GMP) en la industria. Este novedoso enfoque de preparación de EM es más eficiente en el tiempo (5 min de homogeneización a alta velocidad) para obtener nanovesículas homólogas a los EV nativos. Produce exponencialmente más vesículas a partir de la misma cantidad de células que la ultracentrifugación, que generalmente se puede aplicar a varios tipos de células.

Protocolo

NOTA: En la Figura 1 se muestra un esquema del método.

1. Preparación y aislamiento de EM

1. Internalización celular de MNPs
   1. Cultivo celular
      1. Suspender 1 × 10⁶ células madre mesenquimales de médula ósea de rata (BMSC), células 293T o células de cáncer epitelial de ovario de ratón (ID8) en medio completo DMEM con suero fetal bovino (FBS) al 10 % y solución de penicilina-estreptomicina (P/S) al 5 % en 2 ml por placa de seis pocillos (ver Tabla de materiales).
      2. Cultivar las células durante la noche a 37 °C y 5% de CO₂.
         NOTA: El número de células después de la adherencia fue de aproximadamente 1 × 10⁶.
   2. Endocitosis de MNPs
      1. Reduzca el volumen medio de cada placa de seis pocillos a 1 ml. Cocultivar las células con nanopartículas de óxido de hierro (IONPs) modificadas con polilisina de 10 nm (ver Tabla de Materiales) a una concentración de 100 μg/1 × 10⁶ células e incubar a 37 °C en una atmósfera que contenga 5% de CO₂ durante 12 h para permitir que las células endocitosen completamente los IONP.
2. Aislamiento y homogeneización de endosomas
   1. Tratamiento hipotónico celular
      1. Digiera las células que tienen IONPs completamente internalizados con tripsina de 0,5 mL/pocillo durante 3 min, y finalice la digestión añadiendo 1 mL/pocillo de medio completo.
      2. Centrifugar a 1000 x g durante 5 min, y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en solución salina tampón fosfato (PBS) y centrifugar, repetidamente dos veces para lavar el medio residual y los IONP no absorbidos.
      3. Finalmente, vuelva a suspender el gránulo en 8 mL en una solución hipotónica preparada previamente (71,4 mM de cloruro de potasio, 1,3 mM de citrato de sodio, pH 7,2-7,4) durante 15 min (ver Tabla de Materiales).
   2. Liberación de orgánulos por homogeneización a baja velocidad
      1. Transfiera la suspensión celular en solución hipotónica a un tubo de ensayo de vidrio y libere los orgánulos usando un homogeneizador de vidrio (ver Tabla de materiales) mediante 20 choques a 1000 rpm.
   3. Separación magnética para la obtención de endosomas
      1. Transfiera 1 ml de la solución celular homogeneizada a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y colóquelo en un separador magnético durante 1 h para separar completamente los endosomas cargados de IONP de otros orgánulos (como el núcleo y las mitocondrias) y los desechos celulares.
      2. Recoja los gránulos marrones en la superficie de contacto de los tubos de microcentrífuga junto al marco magnético (consulte la tabla de materiales), es decir, los endosomas cargados de IONP. Deseche el líquido en los tubos de microcentrífuga y agregue 3 ml de PBS para resuspender los endosomas.
3. Homogeneización de alta velocidad
   1. Transfiera la solución que contiene los endosomas a un tubo de centrífuga de 15 ml con un volumen de líquido entre 3 y 10 ml.
   2. Extienda la sonda de 10 mm del homogeneizador de alta velocidad (consulte la tabla de materiales) hasta el fondo del tubo de centrífuga sin tocar el fondo. Ajuste el botón Velocidad debajo de la pantalla, establezca la velocidad en 140 x g y ajuste el botón Tiempo para establecer el tiempo de 5 minutos, luego presione el botón OK .
   3. Presione el botón Inicio para realizar la homogeneización después de colocar una caja de hielo debajo de la muestra.
4. Clasificación magnética para EM
   1. Transferir la solución que contiene nanovesículas obtenida de la homogeneización a alta velocidad al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y colocarla en un separador magnético durante 1 h.
   2. Recoja el líquido que contiene los EM requeridos. Tenga cuidado de no tocar la superficie de los tubos junto al marco magnético, que adsorbió IONP libres y EM cargados de IONP.

2. Caracterización de EM (Figura 2 y Figura 3)

1. Análisis de dispersión dinámica de la luz (DLS)
   1. Inyecte 1 ml de muestra de EMs (20 μg/ml) a lo largo de la pared en la cubeta y colóquela en la ranura de muestra del instrumento DLS (consulte la tabla de materiales).
   2. Abra el software DLS, seleccione Prueba de tamaño de partícula y comience a probar.
   3. Mida la concentración de proteínas con un kit de ensayo de proteínas BCA (consulte la tabla de materiales).
2. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
   1. Diluir los EM con PBS en una solución a 1 × 10^7-1 × 10⁸ partículas/ml e inyectarlos en la cámara del instrumento NTA (ver Tabla de materiales) utilizando una jeringa de 1 ml a un caudal de 500-1000 μl/min.
   2. Abra los 488 canales láser y asegúrese de que el número de EM en la interfaz del software esté dentro de 100-300 y en movimiento browniano.
   3. De acuerdo con el protocolo del fabricante, seleccione el SOP apropiado (EV-488) para asegurarse de que la sensibilidad del instrumento sea adecuada para la detección de EM.
3. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
   1. Fije los EM (1 mg/mL) con un volumen igual de glutaraldehído al 5% durante 30 min, y cuantifique la concentración de EM como 1 mg/mL mediante el kit de ensayo de proteína BCA.
   2. Coloque una gota de 10 μL de EM en el lado de carbono de la malla de cobre y elimine el exceso de líquido del lado con papel de filtro después de 10 minutos. Añadir 10 μL de PBS y secar inmediatamente con papel de filtro. Repita dos veces para eliminar el exceso de glutaraldehído.
   3. Deje caer 5 μL de agente de contraste de acetato de uranilo y tiña negativamente durante 1 minuto, luego retire el exceso de agente de contraste. Lavar tres veces con agua desionizada y secar a temperatura ambiente (RT).
   4. Grabación de imagen por un TEM a una tensión de aceleración de 100 kV.
4. Western blot
   1. Añadir 100 μL de tampón de lisis celular y 5 μL de un cóctel de inhibidores de la proteasa 50x a las muestras (ver Tabla de Materiales). Mezclar suavemente con una pistola de pipetas y poner en hielo durante 30 min.
   2. Centrifugar la solución a 1000 x g durante 10 min a 4 °C, cuantificar la concentración de proteína del sobrenadante con un kit de ensayo de proteína BCA y recogerla.
   3. Mezclar el sobrenadante de 100 μL con 25 μL de tampón de carga de proteínas 5x y calentar a 95 °C durante 10 min.
   4. Prepare los geles de acuerdo con las instrucciones de los geles preformados. Cargue 15 μg de proteína por pocillo y haga funcionar mediante electroforesis en gel a 80 V. Espere a que la muestra corra hacia el gel de separación, cambie a 100 V y luego transfiera la proteína a una membrana de nitrocelulosa a 100 V, 60 min bajo baño de hielo.
   5. Detectar los marcadores no específicos de EV (calnexina) y los biomarcadores de EV (anexina y CD63) mediante Western blot (ver Tabla de materiales).
      NOTA: Los anticuerpos se diluyen según las recomendaciones del fabricante.

3. Detección de la función EM in vitro

1. Etiquetado de EMs
   1. Mezclar 1 μL de PKH26 con 250 μL de diluyente C (1:250) para hacer 2x solución de tinción (4 × ^10-6 M) (ver Tabla de Materiales).
   2. Mezcle 250 μL de EM (1 mg/mL) con 250 μL de solución de tinción 2x y sople rápidamente con una pistola de pipeteo.
   3. Incubar en RT durante 2-5 minutos mientras se invierte suavemente el tubo de la centrífuga.
   4. Añadir un volumen igual de suero o 1% de proteína sérica bovina e incubar durante 1 min para finalizar la digestión.
   5. Eliminar el exceso de PKH26 mediante ultrafiltración con tubos de ultrafiltración de 1000 KD a 3000 x g durante 30 min, y repetir tres veces añadiendo PBS. Vuelva a suspender el líquido restante a 500 μL con PBS y filtre a través de un filtro de 0,22 μm.
2. Ensayo de captación de células
   1. Inoculación celular: Sembrar 1 × 10⁶ células en placas confocales de 35 mm con 1 mL de DMEM que contenga 10% de FBS y 5% P/S, e incubar a 37 °C y 5% de CO₂ durante la noche.
   2. Filtre los EM con filtros de jeringa estériles de 0,22 μm para eliminar la posible contaminación.
   3. Tratar las células con EM marcadas con PKH26 (10⁹ partículas/ml) durante 8 h.
   4. Lavar tres veces con PBS, añadir DAPI (10 ng/mL) e incubar durante 10 min a RT.
   5. Adquiera las imágenes de fluorescencia en microscopía de fluorescencia de barrido láser confocal utilizando los canales láser de 405 nm y 561 nm (consulte la tabla de materiales).

Resultados

En la Figura 1 se muestra el flujo de trabajo de la preparación EM mediante homogeneización de alta velocidad asistida por separación magnética. Las células internalizan IONP modificados con polilisina de 10 nm, que se acumulan específicamente en los endosomas a través de la endocitosis (Figura 3A). Después de ser tratados con tampón hipotónico y homogeneizados, los endosomas cargados de IONP se liberan de las células y posteriormente se recogen por s...

Discusión

Como sustituto de la terapia libre de células y de un sistema de administración de fármacos a nanoescala, los VE aún no han cumplido sus expectativas clínicas, y uno de los principales obstáculos es la falta de métodos de producción y purificación escalables y reproducibles⁶. Por lo tanto, se han desarrollado varios tipos de EM como análogos de EV con una complejidad biológica similar¹⁴. Hasta la fecha, el ejemplo de EM más utilizado son las nanovesículas deriv...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin antibody	ABclonal	A11235	Western blotting
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Calnexin	GeneTex	HL1598	Western blotting
CD63 antibody	ABclonal	A19023	Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP	Beyotime	P0013	Western blotting
Centrifuge	Beckman	Allegra X-30R	Cell centrifuge
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	NIKON	A1 HD25	Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)	GIBCO	C11995500BT	Cell culture
Dynamic light scattering (DLS)	Malvern	Zetasizer Nano ZS ZEN3600	Diameter analysis
Electric glass homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	DY89-II	Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS	system Bioscience	EXO-FBS-50A-1	Cell culture
High-speed homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	XHF-DY	High-speed homogenization
Magnetic grate	Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)	NA	Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT	The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag1100-10	Cell culture
Potassium chloride	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail	Beyotime	P1030	Proteinase inhibitor
Sodium citrate	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100plus	Morphology image
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers	Particle Metrix	PMX120	Nanoparticle tracking analysis