Un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de vesículas derivadas de endosomas

Resumen

Aquí, describimos un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas como un nuevo tipo de imitadores de exosomas (EM) que comparten el mismo origen biológico y una estructura, morfología y composición proteica similares de las vesículas extracelulares (EV) nativas.

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) han atraído una atención significativa en la investigación fisiológica y patológica, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades; Sin embargo, su traslación clínica se ha visto limitada por la falta de enfoques de fabricación a escala. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas como un nuevo tipo de imitadores de exosomas (EM) derivados de los endosomas, que tienen un rendimiento aproximadamente 100 veces mayor que el método de ultracentrifugación convencional. En este método, las nanopartículas magnéticas (MNP) fueron internalizadas por las células parentales a través de la endocitosis y posteriormente se acumularon dentro de sus endosomas. A continuación, se recogieron los endosomas cargados de MNPs y se purificaron mediante tratamiento hipotónico y separación magnética. Se utilizó un homogeneizador de alta velocidad para romper los endosomas cargados con MNP en nanovesículas monodispersas. Las vesículas derivadas del endosoma resultantes presentan el mismo origen biológico y estructura, caracterizadas por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el microscopio electrónico de transmisión y la transferencia occidental. Su morfología y composición proteica son similares a las de los VE nativos, lo que indica que los ME pueden servir potencialmente como un sustituto de bajo costo y alto rendimiento de los VE nativos para traducciones clínicas.

Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) son pequeñas vesículas secretadas por casi todas las células con un rango de tamaño de 30-150 nm, que contienen abundantes sustancias bioactivas. Dependiendo de la célula de origen, las VE muestran una alta heterogeneidad, poseyendo múltiples componentes específicos de las células parentales¹. Las VE se liberan en los fluidos corporales y se transportan a sitios distantes donde son absorbidas por las células diana para la acción², que se puede utilizar para administrar una amplia gama de moléculas bioactivas y fármacos para la reparación de tejidos, el diagnóstico y tratamiento de tumore....

Protocolo

NOTA: En la Figura 1 se muestra un esquema del método.

1. Preparación y aislamiento de EM

1. Internalización celular de MNPs
   1. Cultivo celular
      1. Suspender 1 × 10⁶ células madre mesenquimales de médula ósea de rata (BMSC), células 293T o células de cáncer epitelial de ovario de ratón (ID8) en medio completo DMEM con suero fetal bovino (FBS) al 10 % y solución de penicilina-estreptomicina (P/S) al 5 % en 2 ml por placa de seis pocillos (ver Tabla de materiales).
      2. Cultivar las células durante la noche a 37 °C y 5% de CO₂.
         NOTA: ....

Discusión

Como sustituto de la terapia libre de células y de un sistema de administración de fármacos a nanoescala, los VE aún no han cumplido sus expectativas clínicas, y uno de los principales obstáculos es la falta de métodos de producción y purificación escalables y reproducibles⁶. Por lo tanto, se han desarrollado varios tipos de EM como análogos de EV con una complejidad biológica similar¹⁴. Hasta la fecha, el ejemplo de EM más utilizado son las nanovesículas deriv.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin antibody	ABclonal	A11235	Western blotting
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Calnexin	GeneTex	HL1598	Western blotting
CD63 antibody	ABclonal	A19023	Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP	Beyotime	P0013	Western blotting
Centrifuge	Beckman	Allegra X-30R	Cell centrifuge
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	NIKON	A1 HD25	Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)	GIBCO	C11995500BT	Cell culture
Dynamic light scattering (DLS)	Malvern	Zetasizer Nano ZS ZEN3600	Diameter analysis
Electric glass homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	DY89-II	Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS	system Bioscience	EXO-FBS-50A-1	Cell culture
High-speed homogenizer	SCIENTZ(Ningbo, China)	XHF-DY	High-speed homogenization
Magnetic grate	Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)	NA	Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT	The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)	Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)	Mag1100-10	Cell culture
Potassium chloride	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail	Beyotime	P1030	Proteinase inhibitor
Sodium citrate	Aladdin	7447-40-7	Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100plus	Morphology image
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers	Particle Metrix	PMX120	Nanoparticle tracking analysis