用于 体外 建模的原代猪视网膜色素上皮细胞的分离

摘要

该方案概述了从当地来源的猪眼中获取和培养原代视网膜色素上皮（RPE）细胞的程序。这些细胞可作为干细胞的高质量替代品，适用于 体外 视网膜研究。

摘要

视网膜色素上皮 （RPE） 是视网膜外层负责支持光感受器的关键单层。RPE 变性通常发生在以进行性视力丧失为特征的疾病中，例如年龄相关性黄斑变性 （AMD）。AMD的研究通常依赖于人类供体的眼睛或诱导多能干细胞（iPSC）来代表RPE。然而，这些RPE来源需要更长的分化期和大量的培养专业知识。此外，一些研究机构，特别是农村地区的研究机构，很难获得捐赠者的眼睛。虽然存在市售的永生化 RPE 细胞系 （ARPE-19），但它缺乏基本的 体内 RPE 特征，并且在许多眼科研究出版物中没有被广泛接受。迫切需要从更容易获得和更具成本效益的来源获得具有代表性的原代 RPE 细胞。该方案阐明了从猪眼睛死后获得的原代RPE细胞的分离和传代培养，这些细胞可以从商业或学术供应商处本地采购。该协议需要组织培养实验室中常见的常见材料。其结果是 iPSC、人类供体眼睛和 ARPE-19 细胞的主要、差异化且具有成本效益的替代品。

引言

视网膜色素上皮 （RPE） 是位于 Bruch 膜和光感受器之间的视网膜外层的单层¹。RPE 细胞与闭塞带-1 （ZO-1） 等蛋白质形成紧密连接，并具有以色素沉着和六边形形态为特征的独特表型 ^2,3。这些细胞有助于血液-视网膜屏障，从而支持光感受器健康并维持视网膜稳态 ^4,5。此外，RPE 细胞通过吸收光和回收光感受器的基本成分在视觉中发挥关键作用⁶.例如，RPE65 是一种在 RPE 细胞中高度表达的蛋白质，可将全反式视黄酯转化为 11-顺式视黄醇 ^7,8。鉴于 RPE 细胞执行的多种功能，它们的功能障碍与各种疾病有关，包括年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变 ^9,10。为了加强对视网膜病变的理解并开发新的治疗方法，经常采用视网膜的体外模型。

为了生成健康或患病视网膜的代表性模型，必须使用模拟 R....

研究方案

该程序中使用的眼睛是从当地经美国农业部检查的肉店死后获得的，并且不使用活体动物进行任何工作。在动物被处死后，大约2小时后眼睛被摘除。由于组织腐烂可能开始发生，因此在运输过程中保持眼睛凉爽以防止进一步腐烂非常重要。在此过程中，眼睛在摘除后立即放入冰箱中。随后，将眼袋放置在 1000 mL 聚丙烯烧杯内，并在 8 L 冷却器内被冰包围。重要的是不要将眼睛直接放在冰上。一旦眼睛到达实验室，RPE细胞的分离就会在生物安全柜内进行。在 3-5 小时内完成此过程至关重要。该协议已针对处理 10 只眼睛进行了优化。

1. 制备 DNase 原液等分试样

注意：建议在隔离之前执行此步骤。

1. 用无菌去离子水制备5mM氯化钙溶液。
   注意： 氯化钙粉末会引起严重的眼睛刺激或损伤。穿戴适当的个人防护装备。
2. 向 DNase 粉末中加入 5 mM 氯化钙溶液（参见 材料表），得到最终 DNase 浓度为 3 mg/mL。确保溶液充分混合。
   注意：DNase 是一种呼吸道致敏危害。不要吸入粉末/物质。
3. 将小体积（例如 1 mL）等分装到微量离心管中。
4. 将等分试样冷冻在-20°C直至使用。

2. 设置解剖区域

讨论

该协议描述了如何从猪眼中分离RPE细胞。在分离后 7 天内可以看到色素沉着和鹅卵石形态（图 1B）。此外，TEER 数据表明紧密结形成²² 和健康的单层（图 5）。这些结果表明，用这种方法分离的RPE细胞与人RPE相似，在视网膜细胞培养模型中是有益的。

这份手稿中使用的眼睛是死后从当地一家肉店获得的，但也可以?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody