Выделение первичных пигментных эпителиальных клеток сетчатки свиньи для моделирования in vitro

Резюме

В этом протоколе описывается процедура получения и культивирования первичных клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаз свиней местного происхождения. Эти клетки служат высококачественной альтернативой стволовым клеткам и подходят для исследований сетчатки in vitro .

Аннотация

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) является важным монослоем во внешней части сетчатки, отвечающим за поддержку фоторецепторов. Дегенерация РПЭ обычно возникает при заболеваниях, характеризующихся прогрессирующей потерей зрения, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Исследования ВМД часто опираются на донорские глаза человека или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) для представления РПЭ. Однако эти источники РПЭ требуют длительных периодов дифференциации и значительного опыта для культивирования. Кроме того, некоторые научно-исследовательские институты, особенно в сельской местности, не имеют легкого доступа к донорским глазам. Несмотря на то, что существует коммерчески доступная иммортализированная клеточная линия RPE (ARPE-19), она не обладает существенными характеристиками RPE in vivo и не получила широкого распространения во многих научных публикациях по офтальмологии. Существует насущная потребность в получении репрезентативных первичных клеток РПЭ из более доступного и экономически эффективного источника. Этот протокол разъясняет изоляцию и субкультуру первичных клеток РПЭ, полученных посмертно из свиных глаз, которые могут быть получены на месте у коммерческих или академических поставщиков. Для этого протокола требуются обычные материалы, которые обычно встречаются в лабораториях для культивирования тканей. В результате получается первичная, дифференцированная и экономически эффективная альтернатива ИПСК, донорским глазам человека и клеткам ARPE-19.

Введение

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой монослой, расположенный в наружной части сетчатки между мембраной Бруха и фоторецепторами¹. Клетки RPE образуют плотные соединения с белками, такими как zonula occludens-1 (ZO-1), и обладают характерным фенотипом, характеризующимся пигментацией и гексагональной морфологией ^2,3. Эти клетки вносят свой вклад в гемато-ретинальный барьер, тем самым поддерживая здоровье фоторецепторов и поддерживая гомеостаз сетчатки ^4,5. Кроме того, клетки RPE играют важнейшую роль в зрении, поглощая свет и перерабатывая важные^{компоненты для} фоторецепторов. Например, RPE65, белок, высоко экспрессируемый в клетках RPE, превращает полностью транс-ретиниловые эфиры в 11-цис-ретинол ^7,8. Учитывая множество функций, выполняемых клетками РПЭ, их дисфункция связана с различными заболеваниями, включая возрастную макулярную дегенерацию и диабетическую ретинопатию ^9,10. Для углубления понимания патологий сетчатки и разработки новых методов лечения часто используются модели сетчатки in vitro.

Для создания репрезентативных моделей здоровой или больной сетчатки необходимо использовать миметический тип клеток RPE. Коммерчески доступная клеточная линия ARPE-19 не имеет нативных фенотипов, таких как пигментация, в то время как ИПСК могут дифференцироваться месяцами 11,12,13. Несмотря на то, что донорские глаза человека могут быть идеальными, они часто недоступны для многих исследовательских лабораторий.

Здесь мы разработали метод использования свиных глаз, которые имеют много общего с человеческими глазами¹⁴, для получения первичных клеток RPE. Эти первичные клетки RPE свиней были использованы в нескольких моделях сетчатки^15,16. Эти клетки не только экономически эффективны, но и требуют меньше времени для получения, чем ИПСК или донорские глаза. Кроме того, они проявляют естественные характеристики, такие как пигментация и микроворсинки. Несмотря на то, что существуют аналогичные протоколы для экстракции РПЭ свиней 17,18,19, этот простой и подробный метод дополнительно подтверждает ферментативную диссоциацию и использует материалы, обычно встречающиеся в большинстве лабораторий клеточных культур.

протокол

Глаза, используемые в этой процедуре, получены посмертно из местной, проверенной Министерством сельского хозяйства США мясной лавки, и никакая работа не выполняется с использованием живых животных. После того, как животные были принесены в жертву, проходит примерно 2 часа, прежде чем глаза будут энуклеированы. Поскольку может начаться разрушение тканей, важно сохранять глаза прохладными во время транспортировки, чтобы предотвратить дальнейшее разрушение. При этой процедуре глаза сразу после энуклеации помещаются в холодильник. Затем мешок с глазами помещается в полипропиленовый стакан объемом 1000 мл и окружается льдом в 8-литровом охладителе. Важно не ставить глаза прямо на лед. После того, как глаза поступают в лабораторию, изоляция клеток РПЭ проводится в шкафу биобезопасности. Очень важно завершить этот процесс в течение 3-5 часов. Этот протокол был оптимизирован для обработки 10 глаз.

1. Подготовка исходных аликвот ДНКазы

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнить этот шаг перед изоляцией.

1. Приготовьте раствор хлористого кальция 5 мМ со стерильной деионизированной водой.
   ВНИМАНИЕ: Порошок хлорида кальция может вызвать сильное раздражение или повреждение глаз. Носите соответствующие СИЗ.
2. Добавьте 5 мМ раствора хлорида кальция к порошку ДНКазы (см. Таблицу материалов), чтобы получить конечную концентрацию ДНКазы 3 мг/мл. Убедитесь, что раствор тщательно перемешан.
   ВНИМАНИЕ: ДНКаза представляет опасность сенсибилизации в дыхательных путях. Не вдыхайте порошок/вещество.
3. Аликвотные небольшие объемы, например, 1 мл, в микроцентрифужные пробирки.
4. Заморозьте аликвоты при -20 °C до использования.

2. Настройка зоны препарирования

1. Перенесите в шкаф биобезопасности стерильные инструменты для диссекции и оборудование для культивирования клеток: хирургическую простыню, чашки Петри, ситечки для клеток, луночные планшеты, марлю, пинцет, ручку скальпеля, лезвие скальпеля и ножницы для радужной оболочки глаза (см. Таблицу материалов).
2. С помощью пинцета разложите хирургическую простыню. Поместите одну 6-луночную пластину на хирургическую простыню и снимите крышку.
3. Поместите аликвоту стерильного фосфатного солевого буфера (DPBS) Dulbecco на лед и поместите его в шкаф биобезопасности.
4. Наполните одну лунку 6-луночной пластины наполовину (примерно 6 мл) 10% раствором повидон-йода.
5. Заполните оставшиеся лунки охлажденным ДПБС.
6. Снимите крышку с одной из чашек Петри и положите ее в перевернутом виде на хирургическую простыню. Отложите основание чашки Петри в качестве контейнера для отходов.
7. Поместите аликвоту питательной среды для клеточных культур (модифицированная среда для орла (DMEM) Dulbecco, 10% фетальная бычья сыворотка (FBS), 1% антибиотики/антимикотики) и аликвоту 0,25% трипсина/ЭДТА на водяную баню с температурой 37 °C.
8. Извлеките исходный раствор ДНКазы из морозильной камеры (см. остальную часть протокола для получения более подробной информации).

3. Удаление наружных тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Наружное удаление тканей может быть выполнено за пределами кабинета биобезопасности. Перед разрезом осмотрите глаз, чтобы убедиться, что склера не проколота, зрачок не затуманен, зрительный нерв присутствует. Отбросьте глаза, не соответствующие этим критериям.

1. Удерживая одной рукой мышцу, прикрепленную к глазу, другой рукой аккуратно отрежьте скальпелем ткань, окружающую склеру. Будьте осторожны, чтобы не раздавить глаз или случайно не разрезать склеру. Если склера прорезана насквозь и обнажает черную внутреннюю часть, выбросьте глаз.
   ВНИМАНИЕ: Перчатка, устойчивая к порезам, настоятельно рекомендуется использовать руку, удерживающую мышцу, для защиты от случайных порезов.
2. Обрежьте зрительный нерв изогнутыми ножницами по радужной оболочке до длины не более 3 мм. Если зрительный нерв слишком длинный, наглазник не будет правильно располагаться в сетчатом фильтре.
3. Положите глаз на лед роговицей вниз.
4. Повторяйте шаги 3.1-3.3 до тех пор, пока из каждого глаза не будут удалены наружные ткани.

4. Вскрытие глаз

1. С помощью пинцета переместите глаз в шкаф биобезопасности и в лунку, содержащую 10% раствор повидон-йода, и поверните глазок, чтобы убедиться, что он полностью покрыт раствором йода. Чтобы инструменты оставались как можно более стерильными, эти пинцеты следует использовать только для прикосновения к внешней стороне глаза.
2. Пока глаз находится в растворе йода, наложите стерильную марлю на неглубокую перевернутую крышку приготовленной ранее чашки Петри. В отдельную чашку Петри поместите ситечко для ячеек. Используйте ситечко для клеток только для поддержки наглазника, а не для разделения клеток.
3. После того, как глаз находится в растворе йода в течение примерно 30 с, промойте глаз, окунув его в лунки, содержащие DPBS, примерно на 5 секунд каждая, двигаясь от лунки к лунке, чтобы постепенно разбавлять раствор йода, и переложите глаз на стерильную марлю.
4. Сделайте небольшой надрез скальпелем ниже ora serrata или примерно на 1/3 вниз от края радужной оболочки.
5. После разреза используйте ножницы для радужной оболочки глаза, чтобы сделать ровный разрез по окружности шара, параллельно роговице. При манипулировании глазом используйте пинцет только для прикосновения к внешней стороне глаза или марлю для поддержания стерильности.
6. Используйте пинцет, чтобы захватить зрительный нерв и осторожно отодвинуть шар от марли. Стекловидное тело должно выпасть из земного шара. При необходимости осторожно встряхните глаз, чтобы помочь сместить стекловидное тело.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если стекловидное тело очень трудно удалить, попробуйте разрезать его ниже на глобусе.
7. Осторожно поместите наглазник в подготовленное ситечко для ячеек внутренней стороной вверх. Если разрез неровный, используйте пинцет, чтобы отрегулировать наглазник, чтобы разрез был как можно ровнее.
8. Аккуратно добавьте охлажденный DPBS в наглазник так, чтобы уровень жидкости был чуть ниже самой нижней точки разреза. Этот DPBS будет удален после удаления нервной сетчатки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем добавляемого DPBS будет варьироваться в зависимости от размера глаза и расположения разреза.
9. Повторяйте шаги 4.1-4.8 до тех пор, пока не будут рассечены все глаза.

5. Удаление нервной сетчатки и диссоциация РПЭ

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий раздел проще выполнять поэтапно. В этой установке этот процесс выполняется для одной партии (обычно 3 стаканов для глаз) за раз. Для шагов 5.1-5.7 каждый шаг должен быть выполнен для всего пакета, прежде чем переходить к следующему шагу.

1. Под фонариком найдите области, где нервная сетчатка (белая/розовая) начинает отделяться от RPE (черная). Затем тупым пинцетом аккуратно захватите приподнятую нервную сетчатку и отклейте ее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет областей, где нервная сетчатка отделяется, используйте пинцет, чтобы осторожно захватить ее в верхней части наглазника. При использовании этого метода, если поврежден РПЭ/сосудистая оболочка, эти клетки не будут диссоциированы во время сбора РПЭ.
2. Аккуратно соберите нервную сетчатку рядом со диском зрительного нерва.
3. Отсасывайте нервную сетчатку с помощью пипетки Пастера, подключенной к вакуумной аспирационной системе. Рекомендуется перьевая аспирация, чтобы помочь в процессе удаления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечник пипетки можно поместить на конец пипетки Пастера для уменьшения всасывания.
4. Осторожно добавьте дополнительно охлажденный DPBS, чтобы заменить то, что было аспирировано.
5. Удалите оставшуюся нервную сетчатку, сделав аспирацию еще раз. На этот раз удалите как можно больше DPBS, не беспокоя при этом открытый RPE.
6. Аккуратно добавьте трипсин в наглазник. Поддерживайте уровень громкости ниже линии разреза и любых участков поврежденных СИЗД, чтобы уменьшить загрязнение.
   ВНИМАНИЕ: Трипсин - это фермент, который вызывает раздражение кожи и глаз при контакте. Носите соответствующие СИЗ.
7. После того, как трипсин будет добавлен в каждый глаз, убедитесь, что крышка чашки Петри заменена. Далее переносят чашку Петри в увлажненный инкубатор при температуре 37 °С и 5%_СО2 на 30 мин.
8. Повторяйте шаги 5.1–5.7 для каждой партии до тех пор, пока не будут обработаны все наглазники.

6. Сбор СИЗОД

1. Соберите клетки RPE из каждой партии глазков (2-3 глазка) и поместите в одну центрифужную пробирку объемом 15 мл, чтобы упростить процесс посева.
   1. Под фонариком осторожно протрите пипеткой объемом 1000 мкл, чтобы вытеснить клетки RPE. Если клетки РПЭ не отделяются, добавляют свежий трипсин и инкубируют еще 10-15 мин. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать сетчатку.
   2. Соберите клетки RPE в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   3. Промойте наглазник питательной средой, чтобы собрать оставшиеся клетки и нейтрализовать трипсин. Убедитесь, что в центрифужной пробирке объемом 15 мл содержится как минимум в два раза больше среды, чем трипсина.
2. Повторяйте шаг 6.1 до тех пор, пока клетки RPE не будут собраны из всех наглазников.
3. Центрифугируют клеточные суспензии при 250 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.

7. Приготовление рабочего раствора ДНКазы

1. Рассчитайте объем исходного раствора ДНКазы 3 мг/мл (приготовленного на этапе 1), необходимый для добавления в питательную среду для клеток для получения конечной концентрации 100 мкг/мл и конечного объема 3 мл на пробирку клеток (т. е. для трех центрифужных пробирок клеток требуется 9 мл раствора ДНКазы 100 мкг/мл).
2. Смешайте соответствующие объемы исходного раствора ДНКазы и питательной среды для клеток. Использование ДНКазы в рабочем растворе помогает предотвратить слипание клеток и позволяет равномерно засеивать клетки.

8. Посев клеток РПЭ

1. После центрифугирования на этапе 6.3 удалите надосадочную жидкость из каждой центрифужной пробирки объемом 15 мл, стараясь не повредить гранулы клеток.
2. Ресуспендант каждой клеточной гранулы в 3 мл рабочего раствора ДНКазы.
3. Центрифужные пробирки объемом 15 мл, содержащие ресуспендированные клетки, помещают в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 15 минут.
4. После инкубации центрифугируют клеточные суспензии при концентрации 150 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. Удалите надосадочную жидкость, стараясь не нарушить клеточные гранулы.
6. Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 3 мл свежей питательной среды для клеток.
7. Для каждой центрифужной пробирки, содержащей 2-3 глазка ячеек РПЭ, засейте одну лунку из 6-луночной пластины (проход 0).
8. Осторожно перенесите засеянную 6-луночную пластину в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO₂.

9. Первичная клеточная культура РПЭ свиней

1. Дайте вновь засеянным клеткам РПЭ прикрепиться в течение 48-72 ч, прежде чем перемещать пластину. Во время первой смены среды можно выполнить промывку свежей питательной средой для клеточных культур, чтобы удалить излишки клеточного мусора.
2. Заменяйте питатель для клеточных культур каждые 48 часов.
3. Когда клетки достигнут слияния, переходят на питательную среду с концентрацией FBS 2% и выдерживают до эксперимента.

10. Валидация ячеек RPE

1. Иммуноцитохимическое (ИКК) окрашивание
   1. Зафиксируйте клетки в 4% формальдегиде в DPBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
   2. Дважды вымойте DPBS.
   3. Пермеабилизацию клеток (при необходимости) с использованием 0,2% Triton-X 100 в DPBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
   4. Дважды вымойте DPBS.
   5. Применяют блокирующий раствор 3% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA) в DPBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
   6. Добавьте первичные антитела в разведении 1:100 (или рекомендуемую концентрацию производителя) (см. Таблицу материалов) и оставьте на 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °C.
   7. Постирайте три раза с DPBS по 5 минут каждый.
   8. Добавьте вторичные антитела (при необходимости) в концентрации 2 мкг/мл (или рекомендуемая концентрация производителя) (см. Таблицу материалов) и оставьте на 1 ч при комнатной температуре.
   9. Промыть три раза DPBS в течение 5 минут каждый, если нанесены вторичные антитела.
   10. Добавьте зонд для ядерного окрашивания в концентрации производителя (см. Таблицу материалов) и оставьте на 25 минут при комнатной температуре.
   11. Вымойте три раза PBS по 5 минут каждый.
   12. Если вы находитесь на вкладыше для клеточной культуры, прикрепите его к предметному стеклу микроскопа с помощью покровного стекла, используя монтажную среду, как описано Rickabaugh and Weatherston et ^al.20. В противном случае ячейки изображения в DPBS.
2. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
   1. Следуйте процедуре, описанной Harris et ^al.21.
3. Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER)
   1. Следуйте протоколу производителя для измерения TEER (см. таблицу материалов) с 1 мл питательной среды в базальной камере¹⁵.
4. Иммуноферментный анализ (ИФА)
   1. Проводят ИФА¹⁵ с использованием мультиплексного набора иммуноферментного анализа человека в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).

Результаты

С помощью этой процедуры первичные клетки RPE были успешно выделены из глаз свиньи. На рисунке 1А показаны клетки RPE через 3 дня после выделения с характерной пигментацией. Через 1 неделю роста клетки полностью слились и образовали здоровый монослой (рис. 1Б)...

Обсуждение

В этом протоколе описывается, как изолировать клетки RPE от глаз свиньи. Пигментация и морфология булыжника наблюдаются в течение 7 дней после изоляции (рис. 1B). Кроме того, данные TEER указывают на плотное соединение²² и здоровый монослой (рис. 5). ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody