In vitroモデリングのための初代ブタ網膜色素上皮細胞の単離

要約

このプロトコルは局部的に供給されたブタの目から第一次網膜の色素の上皮(RPE)のセルを得、培養するためのプロシージャを概説する。これらの細胞は、幹細胞の高品質な代替品として機能し、 in vitro 網膜研究に適しています。

要約

網膜色素上皮(RPE)は、光受容体を支える網膜外部の重要な単層です。RPE変性症は、加齢黄斑変性症(AMD)などの進行性の視力低下を特徴とする疾患で一般的に発生します。AMDの研究は、RPEを表すために、ヒトのドナーの目や人工多能性幹細胞(iPS細胞)に頼ることがよくあります。しかし、これらのRPE源は、培養のための長い分化期間とかなりの専門知識を必要とします。さらに、一部の研究機関、特に農村部では、ドナーの目へのアクセスが容易ではありません。市販の不死化RPE細胞株(ARPE-19)は存在するが、in vivo RPEの本質的な特徴を欠いており、多くの眼科研究出版物では広く受け入れられていない。代表的な一次RPE細胞を、より容易に入手でき、費用対効果の高い供給源から入手することが急務となっています。このプロトコルは商業か学術の製造者から局部的に供給することができるブタの目から死後得られる第一次RPEのセルの隔離そしてsubcultureを解明する。このプロトコルには、組織培養ラボで一般的に見られる一般的な材料が必要です。その結果、iPS細胞、ヒトドナー眼球、ARPE-19細胞に代わる、分化型で費用対効果の高い一次代替細胞が誕生しました。

概要

網膜色素上皮(RPE)は、ブルッフ膜と視細胞¹の間の網膜外に位置する単層である。RPE細胞は、閉塞帯帯-1(ZO-1)などのタンパク質とタイトジャンクションを形成し、色素沈着と六角形の形態を特徴とする独特の表現型を持っています^2,3。これらの細胞は血液網膜関門に寄与し、それによって視細胞の健康をサポートし、網膜の恒常性を維持します^4,5。さらに、RPE細胞は、光を吸収し、光受容体に不可欠な成分をリサイクルすることにより、視覚において重要な^{役割を果たします6}。例えば、RPE細胞で高発現するタンパク質であるRPE65は、オールトランスレチニルエステルを11-シスレチノール^7,8に変換します。RPE細胞が果たす機能の多さを考えると、その機能不全は、加齢黄斑変性症や糖尿病性網膜症などのさまざまな疾患に関与しています^9,10。網膜の病状の理解を深め、新しい治療法を開発するために、網膜のin vitroモデルが頻繁に採用されています。

健康な網膜または病気の網膜の代表的なモデルを生成するには、模倣RPE細胞タイプを使用することが不可欠です。市販のARPE-19細胞株は、色素沈着などの天然表現型を欠いていますが、iPS細胞は^11,12,13を分化するのに数ヶ月かかることがあります。ヒトのドナーの目は理想的かもしれませんが、多くの研究室ではすぐには入手できないことがよくあります。

ここでは、ヒトの目と多くの類似点を持つブタの目¹⁴を利用して、初代RPE細胞を得る方法を考案した。これらの初代ブタRPE細胞は、複数の網膜モデルで利用されている^15,16。これらの細胞は費用対効果が高いだけでなく、iPS細胞やドナーの眼球よりも取得に要する時間が短くて済みます。さらに、色素沈着や微絨毛などの天然の特徴を示します。ブタRPE抽出のための同様のプロトコルが存在します^が17,18,19、この単純で詳細な技術は、酵素解離をさらに検証し、ほとんどの細胞培養ラボで一般的に見られる材料を採用しています。

プロトコル

この手順で使用される目は、USDAが検査した地元の精肉店から死後採取され、生きた動物を使用した作業は行われません。動物が犠牲にされた後、眼球が摘出されるまでに約2時間が経過します。組織の腐敗が起こり始める可能性があるため、さらなる腐敗を防ぐために、輸送中は目を涼しく保つことが重要です。この手順では、眼球摘出後すぐに冷蔵庫に入れます。その後、目の袋を1000mLのポリプロピレンビーカーに入れ、8Lのクーラーボックス内で氷で囲みます。氷に直接目を置かないことが重要です。眼球が実験室に到着すると、RPE細胞の分離はバイオセーフティキャビネット内で行われます。このプロセスを3〜5時間以内に完了することが重要です。このプロトコルは、10 個の目を処理するように最適化されています。

1. DNaseストックアリコートの調製

注: この手順は、分離の前に実行することをお勧めします。

1. 滅菌脱イオン水で 5 mM 塩化カルシウム溶液を調製します。
   注意: 塩化カルシウム粉末は、重度の眼の炎症や損傷を引き起こす可能性があります。適切なPPEを着用してください。
2. 5 mM 塩化カルシウム溶液を DNase 粉末( 材料表を参照)に添加し、最終的な DNase 濃度を 3 mg/mL にします。溶液が完全に混合されていることを確認してください。
   注意:DNaseは呼吸器感作の危険性があります。粉末/物質を吸い込まないでください。
3. 少量(例えば1 mL)を微量遠心チューブに分注します。
4. アリコートは、使用するまで-20°Cで凍結してください。

2. 解剖エリアの設置

1. 無菌解剖器具と細胞培養装置をバイオセーフティキャビネットに移します:外科用ドレープ、ペトリ皿、細胞ストレーナー、ウェルプレート、ガーゼ、ピンセット、メスのハンドル、メスの刃、虹彩はさみ( 材料表を参照)。
2. ピンセットを使用して、外科用ドレープをレイアウトします。外科用ドレープの上に6ウェルプレートを1枚置き、蓋を外します。
3. 滅菌済みのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)のアリコートを氷上およびバイオセーフティキャビネットに入れます。
4. 6ウェルプレートの1ウェルを半分(約6 mL)に10%ポビドンヨード溶液で満たします。
5. 残りのウェルを冷やしたDPBSで満たします。
6. ペトリ皿の1つから蓋を外し、逆さにして外科用ドレープの上に置きます。ペトリ皿のベースを廃棄物容器として取っておきます。
7. 細胞培養培地(ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%抗生物質/抗真菌薬)のアリコートと0.25%トリプシン/EDTAのアリコートを37°Cのウォーターバスに入れます。
8. DNaseストック溶液を冷凍庫から取り出します(詳細については、プロトコルの残りの部分を参照)。

3.外部組織の除去

注:外部組織の除去は、バイオセーフティキャビネットの外で行うことができます。切断する前に目を検査して、強膜に穴が開いていないこと、瞳孔が曇っていないこと、視神経が存在することを確認してください。これらの基準を満たさない目は破棄します。

1. 片手で眼球に付着した筋肉を持ちながら、もう片方の手で強膜の周りの組織をメスで優しく切り取ります。目をつぶったり、誤って強膜を切ったりしないように注意してください。強膜が切り裂かれて黒い内部が露出している場合は、目を捨てます。
   注意: 偶発的な切り傷から保護するために、筋肉を保持する手には耐切創性手袋を強くお勧めします。
2. 湾曲した虹彩はさみで視神経を3mm以下の長さにトリミングします。視神経が長すぎると、アイカップが後でセルストレーナーに適切に収まりません。
3. 角膜を下にして氷の上に目を置きます。
4. 外装組織が各目から取り除かれるまで、手順3.1〜3.3を繰り返します。

4.眼の解剖

1. ピンセットを使用して、バイオセーフティキャビネットと10%ポビドンヨード溶液を含むウェルに眼球を移し、眼球を回転させてヨウ素溶液で完全にコーティングされていることを確認します。ツールをできるだけ無菌に保つために、これらのピンセットは目の外側に触れる場合にのみ使用する必要があります。
2. 目がヨウ素溶液に浸かっている間に、先ほど準備したペトリ皿の浅い逆蓋に滅菌ガーゼを置きます。別のペトリ皿に、セルストレーナーを置きます。セルストレーナーは、細胞分離ではなく、アイカップを支えるためにのみ使用してください。
3. 眼をヨウ素溶液に約30秒間浸した後、DPBSを含むウェルにそれぞれ約5秒間浸して眼を洗浄し、ウェルからウェルへと移動してヨウ素溶液を徐々に希釈し、滅菌ガーゼの上に眼を移します。
4. オラセラタの下、または虹彩の端から約1/3下にメスを使用して小さな切開を行います。
5. 切開に続いて、虹彩ハサミを使用して、角膜と平行に地球の円周に沿って均等に切断します。目を操作するときは、ピンセットのみを使用して目の外側に触れるか、ガーゼを使用して無菌状態を維持します。
6. ピンセットを使って視神経をつかみ、地球儀をガーゼからそっと持ち上げます。硝子体は地球から落ちるはずです。必要に応じて、硝子体を取り除くために目を静かに振ってください。
   注意: 硝子体を取り除くのが非常に難しい場合は、地球の下部をカットしてみてください。
7. アイカップの内部を上に向けて、準備したセルストレーナーにアイカップをそっと置きます。不均一な場合は、ピンセットを使用してアイカップを調整し、切開をできるだけ水平にします。
8. 冷却したDPBSをアイカップにそっと加え、液面が切開部の最低点のすぐ下になるようにします。このDPBSは、神経網膜除去後に除去されます。
   注:追加されるDPBSの量は、目の大きさと切開位置によって異なります。
9. すべての目が解剖されるまで、手順4.1〜4.8を繰り返します。

5. 神経網膜除去とRPE解離

注: 次のセクションは、段階的に実行する方が簡単です。このセットアップでは、このプロセスは一度に 1 つのバッチ (通常は 3 つのアイ カップ) で実行されます。ステップ 5.1 から 5.7 では、次のステップに進む前に、各ステップをバッチ全体で実行する必要があります。

1. 懐中電灯の下で、神経網膜(白/ピンク)がRPE(黒)から剥離し始めている領域を見つけます。次に、鈍いピンセットを使用して、持ち上げられた神経網膜をそっとつかみ、剥がします。
   注意: 神経網膜が剥離している領域がない場合は、ピンセットを使用してアイカップの上部付近をそっとつかみます。この方法を使用すると、RPE /脈絡膜に損傷が加えられた場合、それらの細胞はRPE収集中に解離されません。
2. 視神経乳頭の近くの神経網膜を静かに集めます。
3. 真空吸引システムに取り付けられたパスツールピペットを使用して神経網膜を吸引します。除去プロセスを支援するために、吸引をフェザーすることをお勧めします。
   注:パスツールピペットの先端にピペットチップをセットして、吸引力を減らすことができます。
4. 冷却したDPBSを慎重に追加して、吸引したものと交換します。
5. もう一度吸引して残った神経網膜を取り除きます。今回は、公開されているRPEを乱さずに、できるだけ多くのDPBSを削除します。
6. トリプシンをアイカップにそっと加えます。コンタミネーションを減らすために、体積レベルを切開線と損傷したRPEのセクションの下に保ちます。
   注意: トリプシンは、接触すると皮膚や目の炎症を引き起こす酵素です。適切なPPEを着用してください。
7. トリプシンを各眼に加えた後、ペトリ皿の蓋が交換されていることを確認します。次に、ペトリ皿を37°C、5%_CO2 の加湿インキュベーターに30分間移します。
8. すべてのアイカップが処理されるまで、バッチごとに手順5.1〜5.7を繰り返します。

6. RPEコレクション

1. 各バッチの目(2〜3目)からRPE細胞を回収し、1本の15 mL遠心チューブに入れて、播種プロセスを簡単にします。
   1. 懐中電灯の下で、1000 μLのピペットを使用して静かにトリチュレーションし、RPE細胞を取り除きます。RPE細胞が剥離しない場合は、新鮮なトリプシンを加え、さらに10〜15分間インキュベートします。網膜をこすらないように注意してください。
   2. RPE細胞を15 mLの遠心チューブに集めます。
   3. アイカップを細胞培養培地で洗浄して、残っている細胞を回収し、トリプシンを中和します。15 mL遠心チューブ内にトリプシンの培地が少なくとも2倍の量あることを確認してください。
2. すべてのアイカップからRPE細胞が収集されるまで、手順6.1を繰り返します。
3. 細胞懸濁液を室温で250 x g で5分間遠心分離します。

7. DNaseワーキングソリューションの準備

1. 細胞培養培地に添加するのに必要な3 mg/mLのDNaseストック溶液(ステップ1で調製)の容量を計算し、最終濃度が100 μg/mL、最終容量が3 mL/細胞チューブあたり3 mLになります(つまり、細胞の遠心分離チューブ3本の場合、100 μg/mLのDNase溶液が9 mL必要です)。
2. 適切な量のDNaseストック溶液と細胞培養培地を組み合わせます。作業溶液にDNaseを使用すると、細胞の凝集を防ぎ、細胞を均一に播種することができます。

8. RPE細胞播種

1. ステップ6.3の遠心分離に続いて、細胞ペレットを破壊しないように注意しながら、各15 mL遠心チューブから上清を取り除きます。
2. 各細胞ペレットを3 mLのDNaseワーキング溶液に再懸濁します。
3. 再懸濁した細胞を入れた15 mL遠心チューブを加湿インキュベーターに37°C、5%_CO2 で15分間入れます。
4. インキュベーション後、細胞懸濁液を室温で150 x g で5分間遠心分離します。
5. 細胞ペレットを破壊しないように注意しながら、上清を取り除きます。
6. 各細胞ペレットを3 mLの新鮮細胞培養培地に再懸濁します。
7. 2〜3眼分のRPE細胞を含む遠心分離管ごとに、6ウェルプレート(継代0)の1ウェルを播種します。
8. 播種した6ウェルプレートを、37°C、5%_CO2の加湿インキュベーターに慎重に移します。

9. 初代ブタRPE細胞培養

1. プレートを移動する前に、新しく播種したRPEセルを48〜72時間付着させます。最初の培地交換では、新鮮な細胞培養培地で洗浄を行うことで、余分な細胞破片を除去することができます。
2. 細胞培養培地は48時間ごとに交換してください。
3. 細胞がコンフルエントに達したら、FBS濃度2%の細胞培養培地に移行し、実験まで維持します。

10. RPEセルの検証

1. 免疫細胞化学(ICC)染色
   1. 細胞をDPBS中の4%ホルムアルデヒドで室温で10分間固定します。
   2. DPBSで2回洗ってください。
   3. 0.2% Triton-X 100 in DPBS を使用して、室温で 10 分間細胞を透過処理します(必要な場合)。
   4. DPBSで2回洗ってください。
   5. 3%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)のブロッキング溶液をDPBSに溶かし、室温で1時間アプライします。
   6. 一次抗体を希釈倍率1:100(またはメーカー推奨濃度)で添加し( 材料表を参照)、室温で1時間、または4°Cで一晩放置します。
   7. DPBSで各5分間3回洗浄します。
   8. 必要に応じて二次抗体を2 μg/mL(またはメーカー推奨濃度)で添加し( 材料表を参照)、室温で1時間放置します。
   9. 二次抗体を添加する場合は、DPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
   10. メーカーの濃度( 材料表を参照)で核染色プローブを添加し、室温で25分間放置します。
   11. PBSで5分間ずつ3回洗浄します。
   12. 細胞培養インサートに装着する場合は、Rickabaugh and Weatherston et ^al.20 で概説されているように、封入培地を使用してカバーガラスを使用して顕微鏡スライドにマウントします。それ以外の場合は、DPBSの画像セル。
2. 走査型電子顕微鏡(SEM)
   1. Harris et ^al.21 によって概説された手順に従ってください。
3. 経上皮電気抵抗(TEER)
   1. TEER測定に関するメーカーのプロトコル( 材料表を参照)に従い、基底チャン^バー15に1mLの培地を添加します。
4. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)
   1. メーカーのプロトコルに従って、マルチプレックスヒト酵素結合免疫吸着アッセイキットを使用してELISA¹⁵ を実施します( 材料表を参照)。

結果

この手順を用いて、初代RPE細胞をブタの眼から単離することに成功しました。 図1A は、特徴的な色素沈着を伴う単離3日後のRPE細胞を示しています。増殖から1週間後、細胞は完全にコンフルエントになり、健康な単層を形成しました(図1B)。その後、細胞を細胞培養インサートに移し、そこで色素沈着と形態を維持し(図1C)、?...

ディスカッション

このプロトコルはブタの目からRPEのセルを隔離する方法を記述する。色素沈着と丸石の形態は、分離後7日以内に見られます(図1B)。さらに、TEERデータは、タイトジャンクション形成²² と健全な単層を示しています(図5)。これらの結果は、この方法で単離されたRPE細胞がヒトRPEに類似しており、網膜細胞培養モデルにおいて有益で?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody