Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines primaires pour la modélisation in vitro

Résumé

Ce protocole décrit la procédure d’obtention et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes primaires (EPR) à partir d’yeux porcins d’origine locale. Ces cellules constituent une alternative de haute qualité aux cellules souches et conviennent à la recherche rétinienne in vitro .

Résumé

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche cruciale dans la rétine externe responsable du soutien des photorécepteurs. La dégénérescence de l’EPR survient généralement dans les maladies marquées par une perte de vision progressive, comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). La recherche sur la DMLA repose souvent sur des yeux de donneurs humains ou des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) pour représenter l’EPR. Cependant, ces sources d’EPR nécessitent des périodes de différenciation prolongées et une expertise substantielle pour la culture. De plus, certains instituts de recherche, en particulier ceux des zones rurales, n’ont pas facilement accès aux yeux des donneurs. Bien qu’il existe une lignée cellulaire d’EPR immortalisée disponible dans le commerce (ARPE-19), elle ne présente pas les caractéristiques essentielles de l’EPR in vivo et n’est pas largement acceptée dans de nombreuses publications de recherche en ophtalmologie. Il est urgent d’obtenir des cellules primaires représentatives de l’EPR à partir d’une source plus facilement disponible et plus rentable. Ce protocole élucide l’isolement et de la sous-culture de cellules primaires de l’EPR obtenues post-mortem à partir d’yeux porcins, qui peuvent être obtenues localement auprès de fournisseurs commerciaux ou universitaires. Ce protocole nécessite des matériaux courants que l’on trouve généralement dans les laboratoires de culture tissulaire. Le résultat est une alternative primaire, différenciée et rentable aux iPSC, aux yeux de donneurs humains et aux cellules ARPE-19.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche située dans la rétine externe entre la membrane de Bruch et les photorécepteurs¹. Les cellules de l’EPR forment des jonctions serrées avec des protéines telles que la zonula occludens-1 (ZO-1) et possèdent un phénotype distinctif caractérisé par la pigmentation et la morphologie hexagonale ^2,3. Ces cellules contribuent à la barrière hémato-rétinienne, soutenant ainsi la santé des photorécepteurs et maintenant l’homéostasie rétinienne ^4,5. De plus, les cellules RPE jouent....

Protocole

Les yeux utilisés dans cette procédure sont obtenus post-mortem d’une boucherie locale inspectée par l’USDA, et aucun travail n’est effectué avec des animaux vivants. Après le sacrifice des animaux, environ 2 heures s’écoulent avant que les yeux ne soient énucléés. Comme la carie des tissus peut commencer à se produire, il est important de garder les yeux au frais pendant le transport pour éviter d’autres caries. Dans cette procédure, les yeux sont immédiatement placés dans un réfrigérateur après l’énucléation. Par la suite, la poche d’yeux est placée à l’intérieur d’un bécher en polypropylène de 1000 mL et entourée de glace dans une glacière de 8 L. Il est important ....

Discussion

Ce protocole décrit comment isoler les cellules EPR des yeux porcins. La pigmentation et la morphologie des pavés sont observées dans les 7 jours suivant l’isolement (Figure 1B). De plus, les données TEER indiquent la formation de jonctions serrées²² et une monocouche saine (Figure 5). Ces résultats montrent que les cellules EPR isolées avec cette méthode sont similaires à l’EPR humaine et peuvent être bénéfiques dans les .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody