Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines primaires pour la modélisation in vitro

Résumé

Ce protocole décrit la procédure d’obtention et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes primaires (EPR) à partir d’yeux porcins d’origine locale. Ces cellules constituent une alternative de haute qualité aux cellules souches et conviennent à la recherche rétinienne in vitro .

Résumé

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche cruciale dans la rétine externe responsable du soutien des photorécepteurs. La dégénérescence de l’EPR survient généralement dans les maladies marquées par une perte de vision progressive, comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). La recherche sur la DMLA repose souvent sur des yeux de donneurs humains ou des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) pour représenter l’EPR. Cependant, ces sources d’EPR nécessitent des périodes de différenciation prolongées et une expertise substantielle pour la culture. De plus, certains instituts de recherche, en particulier ceux des zones rurales, n’ont pas facilement accès aux yeux des donneurs. Bien qu’il existe une lignée cellulaire d’EPR immortalisée disponible dans le commerce (ARPE-19), elle ne présente pas les caractéristiques essentielles de l’EPR in vivo et n’est pas largement acceptée dans de nombreuses publications de recherche en ophtalmologie. Il est urgent d’obtenir des cellules primaires représentatives de l’EPR à partir d’une source plus facilement disponible et plus rentable. Ce protocole élucide l’isolement et de la sous-culture de cellules primaires de l’EPR obtenues post-mortem à partir d’yeux porcins, qui peuvent être obtenues localement auprès de fournisseurs commerciaux ou universitaires. Ce protocole nécessite des matériaux courants que l’on trouve généralement dans les laboratoires de culture tissulaire. Le résultat est une alternative primaire, différenciée et rentable aux iPSC, aux yeux de donneurs humains et aux cellules ARPE-19.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche située dans la rétine externe entre la membrane de Bruch et les photorécepteurs¹. Les cellules de l’EPR forment des jonctions serrées avec des protéines telles que la zonula occludens-1 (ZO-1) et possèdent un phénotype distinctif caractérisé par la pigmentation et la morphologie hexagonale ^2,3. Ces cellules contribuent à la barrière hémato-rétinienne, soutenant ainsi la santé des photorécepteurs et maintenant l’homéostasie rétinienne ^4,5. De plus, les cellules RPE jouent un rôle essentiel dans la vision en absorbant la lumière et en recyclant les composants essentiels pour les photorécepteurs⁶. Par exemple, RPE65, une protéine fortement exprimée dans les cellules RPE, convertit les esters de rétinyle tout-trans en rétinol 11-cis ^7,8. Compte tenu de la multitude de fonctions remplies par les cellules EPR, leur dysfonctionnement est impliqué dans diverses maladies, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge et la rétinopathie diabétique ^9,10. Pour améliorer la compréhension des pathologies rétiniennes et développer de nouveaux traitements, des modèles in vitro de la rétine sont fréquemment utilisés.

Pour générer des modèles représentatifs de rétines saines ou malades, il est impératif d’utiliser un type de cellule RPE mimétique. La lignée cellulaire ARPE-19 disponible dans le commerce n’a pas de phénotypes natifs, tels que la pigmentation, tandis que les iPSC peuvent prendre des mois pour se différencier 11,12,13. Bien que les yeux de donneurs humains puissent être idéaux, ils ne sont souvent pas facilement accessibles à de nombreux laboratoires de recherche.

Ici, nous avons conçu une méthode pour utiliser les yeux porcins, qui partagent de nombreuses similitudes avec les yeux humains¹⁴, pour obtenir des cellules primaires de l’EPR. Ces cellules primaires de l’EPR porcine ont été utilisées dans plusieurs modèles rétiniens^15,16. Non seulement ces cellules sont rentables, mais elles nécessitent également moins de temps à acquérir que les iPSC ou les yeux du donneur. De plus, ils présentent des caractéristiques natives, telles que la pigmentation et les microvillosités. Bien qu’il existe des protocoles similaires pour l’extraction de l’EPR porcin 17,18,19, cette technique simple et détaillée valide davantage la dissociation enzymatique et utilise des matériaux couramment trouvés dans la plupart des laboratoires de culture cellulaire.

Protocole

Les yeux utilisés dans cette procédure sont obtenus post-mortem d’une boucherie locale inspectée par l’USDA, et aucun travail n’est effectué avec des animaux vivants. Après le sacrifice des animaux, environ 2 heures s’écoulent avant que les yeux ne soient énucléés. Comme la carie des tissus peut commencer à se produire, il est important de garder les yeux au frais pendant le transport pour éviter d’autres caries. Dans cette procédure, les yeux sont immédiatement placés dans un réfrigérateur après l’énucléation. Par la suite, la poche d’yeux est placée à l’intérieur d’un bécher en polypropylène de 1000 mL et entourée de glace dans une glacière de 8 L. Il est important de ne pas placer les yeux directement sur la glace. Une fois les yeux arrivés au laboratoire, l’isolement des cellules EPR est effectué dans une enceinte de biosécurité. Il est crucial de terminer ce processus dans les 3 à 5 heures. Ce protocole a été optimisé pour le traitement de 10 yeux.

1. Préparation des aliquotes de base DNase

REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer cette étape avant l’isolement.

1. Préparez une solution de chlorure de calcium de 5 mM avec de l’eau désionisée stérile.
   ATTENTION : La poudre de chlorure de calcium peut provoquer une irritation ou des lésions oculaires graves. Portez l’EPI approprié.
2. Ajouter 5 mM de solution de chlorure de calcium à la poudre de DNase (voir le tableau des matériaux) pour obtenir une concentration finale de DNase de 3 mg/mL. Assurez-vous que la solution est bien mélangée.
   ATTENTION : La DNase présente un risque de sensibilisation respiratoire. Ne pas inhaler la poudre/substance.
3. Aliquote de petits volumes, par exemple 1 mL, dans des tubes de microcentrifugation.
4. Congeler les aliquotes à -20 °C jusqu’à utilisation.

2. Mise en place de la zone de dissection

1. Transférez les instruments de dissection stériles et le matériel de culture cellulaire dans l’enceinte de biosécurité : champ chirurgical, boîtes de Pétri, passoires cellulaires, plaques à puits, gaze, pince à épiler, manche de scalpel, lame de scalpel et ciseaux à iris (voir tableau des matériaux).
2. À l’aide d’une pince à épiler, disposez le champ chirurgical. Placez une plaque à 6 puits sur le champ chirurgical et retirez le couvercle.
3. Placer une aliquote de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) stérile sur de la glace et dans l’enceinte de biosécurité.
4. Remplir un puits d’une plaque de 6 puits à moitié pleine (environ 6 ml) de solution de povidone iodée à 10 %.
5. Remplissez les puits restants avec du DPBS réfrigéré.
6. Retirez le couvercle de l’une des boîtes de Pétri et placez-le, à l’envers, sur le champ chirurgical. Mettez de côté la base de la boîte de Pétri comme récipient à déchets.
7. Placer une aliquote de milieu de culture cellulaire (milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM), 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 % d’antibiotiques/antimycosiques) et une aliquote de 0,25 % de trypsine/EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
8. Retirez la solution mère de DNase du congélateur (voir le reste du protocole pour plus de détails).

3. Retrait des tissus extérieurs

REMARQUE : L’ablation des tissus extérieurs peut être effectuée à l’extérieur de l’enceinte de biosécurité. Inspectez l’œil avant de couper pour vous assurer que la sclérotique n’a pas été perforée, que la pupille n’est pas embuée et que le nerf optique est présent. Jetez les yeux qui ne répondent pas à ces critères.

1. Tout en tenant le muscle attaché à l’œil d’une main, utilisez l’autre main pour couper doucement le tissu entourant la sclère avec un scalpel. Veillez à ne pas écraser l’œil ou à ne pas couper accidentellement la sclère. Si la sclérotique est coupée et expose l’intérieur noir, jetez l’œil.
   ATTENTION : Un gant résistant aux coupures est fortement recommandé pour la main qui tient le muscle afin de se protéger contre les coupures accidentelles.
2. Coupez le nerf optique avec des ciseaux à iris incurvés à une longueur ne dépassant pas 3 mm. Si le nerf optique est trop long, l’œilleton ne s’installera pas correctement dans la crépine cellulaire plus tard.
3. Placez l’œil sur de la glace avec la cornée vers le bas.
4. Répétez les étapes 3.1 à 3.3 jusqu’à ce que le tissu externe soit retiré de chaque œil.

4. Dissection oculaire

1. Utilisez une pince à épiler pour transférer un œil dans l’enceinte de sécurité biologique et dans le puits contenant une solution de povidone iodée à 10 % et faites pivoter l’œil pour vous assurer qu’il est entièrement recouvert de la solution d’iode. Pour garder les outils aussi stériles que possible, ces pinces à épiler ne doivent être utilisées que pour toucher l’extérieur de l’œil.
2. Pendant que l’œil est assis dans une solution d’iode, placez une gaze stérile sur le couvercle inversé peu profond de la boîte de Pétri préparée précédemment. Dans une boîte de Pétri séparée, placez une passoire cellulaire. N’utilisez la crépine que pour soutenir l’œilleton, et non pour séparer les cellules.
3. Après avoir laissé l’œil reposer dans une solution d’iode pendant environ 30 s, lavez-le en le plongeant dans les puits contenant du DPBS pendant environ 5 s chacun, en vous déplaçant de puits en puits pour diluer progressivement la solution d’iode, et transférez l’œil sur la gaze stérile.
4. Faites une petite incision à l’aide d’un scalpel sous l’ora serrata, ou à environ 1/3 du globe à partir du bord de l’iris.
5. Après l’incision, utilisez des ciseaux à iris pour couper uniformément le long de la circonférence du globe, parallèlement à la cornée. Lorsque vous manœuvrez l’œil, utilisez uniquement la pince à épiler pour toucher l’extérieur de l’œil ou la gaze pour maintenir la stérilité.
6. Utilisez la pince à épiler pour saisir le nerf optique et soulevez doucement le globe de la gaze. Le vitré devrait tomber du globe. Si nécessaire, secouez doucement l’œil pour aider à déloger le vitré.
   REMARQUE : Si le vitré est très difficile à enlever, essayez de couper plus bas sur le globe.
7. Placez délicatement l’œilleton dans la passoire à cellules préparée, avec l’intérieur de l’œilleton vers le haut. Si elle est inégale, utilisez une pince à épiler pour ajuster l’œilleton afin d’obtenir l’incision aussi plane que possible.
8. Ajoutez doucement du DPBS refroidi dans l’œilleton de manière à ce que le niveau de liquide soit juste en dessous du point le plus bas de l’incision. Ce DPBS sera retiré après l’ablation de la rétine neurale.
   REMARQUE : Le volume de DPBS ajouté varie en fonction de la taille de l’œil et de l’emplacement de l’incision.
9. Répétez les étapes 4.1 à 4.8 jusqu’à ce que tous les yeux soient disséqués.

5. Élimination de la rétine neurale et dissociation de l’EPR

REMARQUE : La section suivante est plus facile à réaliser par étapes. Dans cette configuration, ce processus est effectué sur un lot (généralement 3 œilletons) à la fois. Pour les étapes 5.1 à 5.7, chaque étape doit être effectuée sur l’ensemble du lot avant de passer à l’étape suivante.

1. Sous une lampe de poche, trouvez les zones où la rétine neurale (blanche/rose) commence à se détacher de l’EPR (noir). Ensuite, utilisez une pince à épiler émoussée pour saisir doucement la rétine neurale soulevée et la décoller.
   REMARQUE : S’il n’y a pas de zones où la rétine neurale se détache, utilisez la pince à épiler pour la saisir doucement près du haut de l’œilleton. En utilisant cette méthode, si des dommages sont causés à l’EPR/choroïde, ces cellules ne seront pas dissociées lors de la collecte de l’EPR.
2. Prélevez doucement la rétine neurale près du disque optique.
3. Aspirer la rétine neurale à l’aide d’une pipette Pasteur fixée à un système d’aspiration intra-utérine. Il est recommandé d’adoucir l’aspiration pour faciliter le processus d’élimination.
   REMARQUE : Une pointe de pipette peut être placée à l’extrémité d’une pipette Pasteur pour réduire l’aspiration.
4. Ajoutez soigneusement des DPBS refroidis supplémentaires pour remplacer ce qui a été aspiré.
5. Retirez la rétine neurale restante en aspirant une fois de plus. Cette fois, retirez autant de DPBS que possible sans perturber l’EPR exposé.
6. Ajoutez délicatement de la trypsine dans l’œilleton. Gardez le niveau de volume en dessous de la ligne d’incision et de toute section d’EPR endommagée pour réduire la contamination.
   ATTENTION : La trypsine est une enzyme qui provoque une irritation de la peau et des yeux au contact. Portez l’EPI approprié.
7. Après avoir ajouté de la trypsine à chaque œil, assurez-vous que le couvercle de la boîte de Pétri est remplacé. Ensuite, transférez la boîte de Pétri dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 30 min.
8. Répétez les étapes 5.1 à 5.7 pour chaque lot jusqu’à ce que tous les œilletons aient été traités.

6. Collecte RPE

1. Prélevez les cellules EPR de chaque lot d’yeux (2-3 yeux) et placez-les dans un seul tube à centrifuger de 15 ml pour faciliter le processus d’ensemencement.
   1. Sous une lampe de poche, triturer doucement à l’aide d’une pipette de 1000 μL pour déloger les cellules EPR. Si les cellules de l’EPR ne se détachent pas, ajoutez de la trypsine fraîche et incubez pendant 10 à 15 minutes supplémentaires. Attention à ne pas gratter la rétine.
   2. Recueillir les cellules EPR dans un tube à centrifuger de 15 ml.
   3. Lavez l’œilleton avec un milieu de culture cellulaire pour recueillir les cellules restantes et neutraliser la trypsine. S’assurer qu’il y a au moins deux fois le volume de milieu à trypsine dans le tube à centrifuger de 15 ml.
2. Répétez l’étape 6.1 jusqu’à ce que les cellules EPR aient été prélevées sur tous les œilletons.
3. Centrifuger les suspensions cellulaires à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.

7. Préparation de la solution de travail DNase

1. Calculer le volume de solution mère de DNase à 3 mg/mL (préparée à l’étape 1) à ajouter au milieu de culture cellulaire pour une concentration finale de 100 μg/mL et un volume final de 3 mL par tube de cellules (c.-à-d. pour trois tubes à centrifuger de cellules, 9 mL de solution de DNase à 100 μg/mL sont nécessaires).
2. Combinez les volumes appropriés de solution mère de DNase et de milieux de culture cellulaire. L’utilisation de DNase dans la solution de travail aide à prévenir l’agglutination des cellules et permet aux cellules d’être ensemencées uniformément.

8. Ensemencement de cellules EPR

1. Après la centrifugation à l’étape 6.3, retirer les surnageants de chaque tube à centrifuger de 15 mL, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire.
2. Remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 3 mL de solution de travail DNase.
3. Placer les tubes à centrifuger de 15 mL contenant les cellules remises en suspension dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 15 min.
4. Après l’incubation, centrifuger les suspensions cellulaires à 150 x g pendant 5 min à température ambiante.
5. Retirez les surnageants en prenant soin de ne pas perturber les granulés cellulaires.
6. Remettre chaque pastille de cellule en suspension dans 3 mL de milieu de culture cellulaire frais.
7. Pour chaque tube à centrifuger contenant 2 à 3 yeux de cellules EPR, ensemencer un puits d’une plaque à 6 puits (passage 0).
8. Transférez délicatement la plaque ensemencée à 6 puits dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂.

9. Culture primaire de cellules EPR porcines

1. Laissez les cellules RPE nouvellement ensemencées se fixer pendant 48 à 72 h avant de déplacer la plaque. Lors du premier changement de milieu, un lavage avec un milieu de culture cellulaire frais peut être effectué pour aider à éliminer les débris cellulaires en excès.
2. Remplacez le milieu de culture cellulaire toutes les 48 h.
3. Lorsque les cellules atteignent la confluence, passer à un milieu de culture cellulaire avec une concentration de FBS de 2 % et maintenir jusqu’à l’expérimentation.

10. Validation des cellules RPE

1. Coloration immunocytochimique (ICC)
   1. Fixer les cellules dans du formaldéhyde à 4 % dans du DPBS pendant 10 min à température ambiante.
   2. Laver deux fois avec DPBS.
   3. Perméabiliser les cellules (si nécessaire) en utilisant 0,2 % de Triton-X 100 dans DPBS pendant 10 min à température ambiante.
   4. Laver deux fois avec DPBS.
   5. Appliquer une solution bloquante d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % (p/v) dans le DPBS pendant 1 h à température ambiante.
   6. Ajouter l’anticorps primaire à une dilution de 1:100 (ou concentration recommandée par le fabricant) (voir le tableau des matières) et laisser reposer pendant 1 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
   7. Lavez trois fois avec DPBS pendant 5 min chacune.
   8. Ajouter l’anticorps secondaire (au besoin) à 2 μg/mL (ou concentration recommandée par le fabricant) (voir le tableau des matières) et laisser reposer pendant 1 h à température ambiante.
   9. Laver trois fois avec du DPBS pendant 5 minutes chacune si des anticorps secondaires sont appliqués.
   10. Ajouter la sonde de coloration nucléaire à la concentration du fabricant (voir le tableau des matériaux) et laisser reposer 25 min à température ambiante.
   11. Lavez trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
   12. S’il s’agit d’un insert de culture cellulaire, monter sur une lame de microscope à l’aide d’une lamelle de recouvrement en utilisant un milieu de montage comme décrit par Rickabaugh et Weatherston et ^al.20. Sinon, imagez les cellules dans DPBS.
2. Microscopie électronique à balayage (MEB)
   1. Suivez la procédure décrite par Harris et ^al.21.
3. Résistance électrique trans-épithéliale (TEER)
   1. Suivre le protocole du fabricant pour la mesure de la FEER (voir le tableau des matières) avec 1 mL de milieu de culture dans la chambre basale¹⁵.
4. Test immuno-enzymatique (ELISA)
   1. Effectuer l’ELISA¹⁵ à l’aide d’une trousse de dosage immuno-enzymatique humain multiplex en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).

Résultats

En utilisant cette procédure, les cellules primaires de l’EPR ont été isolées avec succès des yeux porcins. La figure 1A montre les cellules EPR 3 jours après l’isolement avec une pigmentation caractéristique. Après 1 semaine de croissance, les cellules étaient complètement confluentes et formaient une monocouche saine (Figure 1B). Les cellules ont ensuite été transférées dans des inserts de culture cellulaire où elles ont conservé leur pigme...

Discussion

Ce protocole décrit comment isoler les cellules EPR des yeux porcins. La pigmentation et la morphologie des pavés sont observées dans les 7 jours suivant l’isolement (Figure 1B). De plus, les données TEER indiquent la formation de jonctions serrées²² et une monocouche saine (Figure 5). Ces résultats montrent que les cellules EPR isolées avec cette méthode sont similaires à l’EPR humaine et peuvent être bénéfiques dans les ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody