Isolamento de células epiteliais pigmentares primárias da retina suína para modelagem in vitro

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento para obtenção e cultivo de células epiteliais pigmentares primárias da retina (EPR) a partir de olhos suínos de origem local. Essas células servem como uma alternativa de alta qualidade às células-tronco e são adequadas para pesquisas in vitro da retina.

Resumo

O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada crucial na retina externa responsável pela sustentação dos fotorreceptores. A degeneração do EPR ocorre comumente em doenças marcadas pela perda progressiva da visão, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). A pesquisa sobre DMRI geralmente se baseia em olhos de doadores humanos ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para representar o EPR. No entanto, essas fontes de EPR requerem longos períodos de diferenciação e conhecimentos substanciais para o cultivo. Além disso, algumas instituições de pesquisa, particularmente aquelas em áreas rurais, não têm fácil acesso aos olhos dos doadores. Embora exista uma linhagem celular de EPR imortalizada comercialmente disponível (ARPE-19), ela carece de características essenciais de EPR in vivo e não é amplamente aceita em muitas publicações de pesquisa em oftalmologia. Há uma necessidade premente de obter células primárias representativas do EPR a partir de uma fonte mais prontamente disponível e econômica. Este protocolo elucida o isolamento e subcultivo de células primárias de EPR obtidas post-mortem de olhos suínos, que podem ser obtidas localmente de fornecedores comerciais ou acadêmicos. Este protocolo necessita de materiais comuns tipicamente encontrados em laboratórios de cultura de tecidos. O resultado é uma alternativa primária, diferenciada e custo-efetiva para iPSCs, olhos de doadores humanos e células ARPE-19.

Introdução

O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada localizada na retina externa entre a membrana de Bruch e os fotorreceptores¹. As células do EPR formam tight junctions com proteínas como a zonula occludens-1 (ZO-1) e possuem um fenótipo distinto, caracterizado por pigmentação e morfologia^hexagonal2,3. Essas células contribuem para a barreira hematorretiniana, apoiando a saúde dos fotorreceptores e mantendo a homeostase retiniana ^4,5. Além disso, as células do EPR desempenham um papel crítico na visão, absorvendo luz e reciclando componentes essenciais para os fotorreceptores⁶. Por exemplo, a RPE65, uma proteína altamente expressa em células de EPR, converte ésteres de retinila trans-trans em retinol 11-cis ^7,8. Dada a multiplicidade de funções desempenhadas pelas células do EPR, sua disfunção está implicada em várias doenças, incluindo degeneração macular relacionada à idade e retinopatia diabética ^9,10. Para melhorar a compreensão das patologias retinianas e desenvolver novos tratamentos, modelos in vitro da retina são frequentemente empregados.

Para gerar modelos representativos de retinas saudáveis ou doentes, é imperativo usar um tipo de célula RPE mimética. A linhagem celular ARPE-19 comercialmente disponível não possui fenótipos nativos, como pigmentação, enquanto as iPSCs podem levar meses para se diferenciar11,12,13. Embora os olhos de doadores humanos possam ser ideais, eles muitas vezes não estão prontamente disponíveis para muitos laboratórios de pesquisa.

Aqui, desenvolvemos um método para utilizar olhos suínos, que compartilham muitas semelhanças com olhos humanos¹⁴, para a obtenção de células primárias do EPR. Essas células primárias do EPR suíno têm sido utilizadas em múltiplos modelos de retina^15,16. Essas células não são apenas custo-efetivas, mas também requerem menos tempo para serem adquiridas do que as iPSCs ou os olhos de doadores. Além disso, apresentam características nativas, como pigmentação e microvilosidades. Embora existam protocolos semelhantes para extração de EPR suíno 17,18,19, essa técnica simples e detalhada valida ainda mais a dissociação enzimática e emprega materiais comumente encontrados na maioria dos laboratórios de cultura celular.

Protocolo

Os olhos usados neste procedimento são obtidos post-mortem de um açougue local, inspecionado pelo USDA, e nenhum trabalho é realizado usando animais vivos. Após o sacrifício dos animais, passam aproximadamente 2 h antes que os olhos sejam enucleados. Como a deterioração do tecido pode começar a ocorrer, é importante manter os olhos frescos durante o transporte para evitar mais decaimento. Neste procedimento, os olhos são imediatamente colocados em uma geladeira após a enucleação. Em seguida, a bolsa dos olhos é posicionada dentro de um copo de polipropileno de 1000 mL e cercada por gelo dentro de um resfriador de 8 L. É importante não colocar os olhos diretamente no gelo. Assim que os olhos chegam ao laboratório, o isolamento das células de EPR é realizado dentro de um gabinete de biossegurança. É crucial concluir este processo dentro de 3-5 h. Este protocolo foi otimizado para o processamento de 10 olhos.

1. Preparação das alíquotas de estoque da DNase

Observação : é recomendável que essa etapa seja executada antes do isolamento.

1. Preparar uma solução de cloreto de cálcio 5 mM com água deionizada estéril.
   CUIDADO: O cloreto de cálcio em pó pode causar irritação ou danos oculares graves. Use EPIs apropriados.
2. Adicionar 5 mM de solução de cloreto de cálcio ao pó de DNase (ver Tabela de Materiais) para obter uma concentração final de DNase de 3 mg/ml. Certifique-se de que a solução está bem misturada.
   CUIDADO: DNase é um risco de sensibilização respiratória. Não inalar pó/substância.
3. Alíquota pequenos volumes, por exemplo 1 mL, em tubos de microcentrífuga.
4. Congelar alíquotas a -20 °C até à utilização.

2. Configuração da área de dissecção

1. Transfira os instrumentos de dissecção estéreis e o equipamento de cultura celular para o gabinete de biossegurança: cortina cirúrgica, placas de Petri, filtros de células, placas de poço, gaze, pinça, cabo de bisturi, lâmina de bisturi e tesoura de íris (ver Tabela de Materiais).
2. Usando uma pinça, coloque o campo cirúrgico. Coloque uma placa de 6 poços sobre o pano cirúrgico e remova a tampa.
3. Coloque uma alíquota de Fosfato Buffered Saline (DPBS) estéril de Dulbecco no gelo e no armário de biossegurança.
4. Encher um poço de uma placa de 6 poços meio cheia (aproximadamente 6 mL) de solução de iodopovidona a 10%.
5. Encha os poços restantes com DPBS refrigerados.
6. Retire a tampa de uma das placas de Petri e coloque-a, invertida, sobre o campo cirúrgico. Separe a base da placa de Petri como recipiente de resíduos.
7. Coloque uma alíquota de meio de cultura celular (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% antibióticos/antimicóticos) e uma alíquota de 0,25% de tripsina/EDTA em banho-maria a 37 °C.
8. Remova a solução-mãe DNase do congelador (consulte o resto do protocolo para obter mais detalhes).

3. Remoção de tecido exterior

NOTA: A remoção de tecido exterior pode ser realizada fora do gabinete de biossegurança. Inspecione o olho antes do corte para garantir que a esclera não foi perfurada, a pupila não está embaçada e o nervo óptico está presente. Descarte os olhos que não atendem a esses critérios.

1. Ao segurar o músculo preso ao olho com uma mão, use a outra mão para cortar suavemente o tecido ao redor da esclera com um bisturi. Tenha cuidado para não esmagar o olho ou cortar acidentalmente a esclera. Se a esclera for cortada e expor o interior preto, descarte o olho.
   CUIDADO: Uma luva resistente ao corte é altamente recomendada para a mão que segura o músculo para proteger contra cortes acidentais.
2. Corte o nervo óptico com uma tesoura de íris curva até um comprimento não superior a 3 mm. Se o nervo óptico for muito longo, o copo ocular não ficará adequadamente no filtro de células mais tarde.
3. Coloque o olho no gelo com a córnea para baixo.
4. Repita os passos 3.1-3.3 até que o tecido exterior seja removido de cada olho.

4. Dissecção ocular

1. Use uma pinça para transferir um olho para o armário de biossegurança e para o poço contendo solução de iodopovidona a 10% e gire o olho para garantir que ele seja totalmente revestido na solução de iodo. Para manter as ferramentas o mais estéreis possível, essas pinças devem ser usadas apenas para tocar o exterior do olho.
2. Enquanto o olho estiver sentado em solução de iodo, coloque uma gaze estéril sobre a pálpebra rasa e invertida da placa de Petri preparada anteriormente. Em uma placa de Petri separada, coloque um filtro de células. Use apenas o filtro de células para apoiar o copo dos olhos, não para a separação celular.
3. Depois de permitir que o olho se sente em solução de iodo por aproximadamente 30 s, lave o olho mergulhando-o nos poços contendo DPBS por aproximadamente 5 s cada, movendo-se de poço em poço para diluir progressivamente a solução de iodo e transferir o olho para a gaze estéril.
4. Faça uma pequena incisão usando um bisturi abaixo da ora serrata, ou aproximadamente 1/3 abaixo do globo a partir da borda da íris.
5. Após a incisão, use tesoura de íris para cortar uniformemente ao longo da circunferência do globo, paralelo à córnea. Ao manobrar o olho, use apenas a pinça para tocar a parte externa do olho ou a gaze para manter a esterilidade.
6. Use a pinça para agarrar o nervo óptico e levantar suavemente o globo para longe da gaze. O vítreo deve cair para fora do globo. Se necessário, agite suavemente o olho para ajudar a desalojar o vítreo.
   NOTA: Se o vítreo for muito difícil de remover, tente cortar mais baixo no globo.
7. Coloque suavemente o copo dos olhos no filtro de células preparado, com o interior do copo dos olhos virado para cima. Se estiver irregular, use uma pinça para ajustar o copo ocular para que a incisão fique o mais nivelada possível.
8. Adicione suavemente DPBS resfriado ao copo dos olhos para que o nível de líquido fique logo abaixo do ponto mais baixo da incisão. Esta DPBS será removida após a remoção da retina neural.
   NOTA: O volume de DPBS adicionado irá variar dependendo do tamanho do olho e da localização da incisão.
9. Repita os passos 4.1-4.8 até que todos os olhos estejam dissecados.

5. Remoção da retina neural e dissociação do EPR

Observação : a seção a seguir é mais fácil de executar em estágios. Nesta configuração, este processo é realizado em um lote (geralmente 3 copos de olhos) de cada vez. Para as etapas 5.1-5.7, cada etapa deve ser executada em todo o lote antes de passar para a próxima etapa.

1. Sob uma lanterna, encontre as áreas onde a retina neural (branca/rosa) está começando a se desprender do EPR (preto). Em seguida, use uma pinça romba para agarrar suavemente a retina neural levantada e descascá-la.
   NOTA: Se não houver áreas onde a retina neural está se desprendendo, use a pinça para agarrá-la suavemente perto da parte superior do copo dos olhos. Usando este método, se houver dano ao EPR/coroide, essas células não serão dissociadas durante a coleta do EPR.
2. Colete suavemente a retina neural perto do disco óptico.
3. Aspirar a retina neural usando uma pipeta de Pasteur conectada a um sistema de aspiração a vácuo. Recomenda-se penar a aspiração para ajudar no processo de remoção.
   NOTA: Uma ponta de pipeta pode ser colocada na extremidade de uma pipeta Pasteur para reduzir a sucção.
4. Adicione cuidadosamente DPBS resfriados adicionais para substituir o que foi aspirado.
5. Remova a retina neural remanescente aspirando novamente. Desta vez, remova o máximo de DPBS possível, sem perturbar o EPR exposto.
6. Adicione suavemente tripsina ao copo dos olhos. Mantenha o nível de volume abaixo da linha de incisão e quaisquer seções de EPR danificadas para reduzir a contaminação.
   CUIDADO: A tripsina é uma enzima que causará irritação na pele e nos olhos ao contato. Use EPIs apropriados.
7. Depois que a tripsina for adicionada a cada olho, certifique-se de que a tampa da placa de Petri seja substituída. Em seguida, transferir a placa de Petri para uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% CO₂ por 30 min.
8. Repita as etapas 5.1-5.7 para cada lote até que todos os óculos tenham sido processados.

6. Coleta de EPR

1. Coletar as células de EPR de cada lote de olhos (2-3 olhos) e colocar em um único tubo de centrífuga de 15 mL para tornar o processo de semeadura simples.
   1. Sob uma lanterna, triture suavemente usando uma pipeta de 1000 μL para desalojar as células de EPR. Se as células do EPR não estiverem se destacando, adicione tripsina fresca e incube por mais 10-15 min. Tenha cuidado para não raspar a retina.
   2. Coletar as células de EPR em um tubo de centrífuga de 15 mL.
   3. Lave o copo ocular com meios de cultura celular para coletar as células restantes e neutralizar a tripsina. Certifique-se de que há pelo menos o dobro do volume de meio para tripsina no tubo de centrífuga de 15 mL.
2. Repetir o passo 6.1 até que as células do EPR tenham sido recolhidas de todos os óculos.
3. Centrifugar as suspensões celulares a 250 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.

7. Preparação da solução de trabalho DNase

1. Calcular o volume de 3 mg/mL de solução-mãe de DNase (preparada na etapa 1) necessária para adicionar ao meio de cultura celular para uma concentração final de 100 μg/mL e volume final de 3 mL por tubo de células (ou seja, para três tubos de centrífuga de células, são necessários 9 mL de solução de DNase a 100 μg/mL).
2. Combinar os volumes apropriados de solução-mãe de DNase e meios de cultura celular. O uso de DNase na solução de trabalho ajuda a prevenir a aglomeração celular e permite que as células sejam semeadas uniformemente.

8. Semeadura de células RPE

1. Após a centrifugação na etapa 6.3, remova os sobrenadantes de cada tubo de centrífuga de 15 mL, com cuidado para não interromper o pellet celular.
2. Ressuspender cada pellet de célula em 3 mL de solução de trabalho DNase.
3. Colocar os tubos de centrífuga de 15 mL contendo as células ressuspensas em uma estufa umidificada a 37 °C e 5% CO₂ por 15 min.
4. Após a incubação, centrifugar as suspensões celulares a 150 x g por 5 min à temperatura ambiente.
5. Remova os sobrenadantes, com cuidado para não atrapalhar os pellets celulares.
6. Ressuspender cada pastilha celular em 3 mL de meio de cultura de células frescas.
7. Para cada tubo de centrífuga contendo 2-3 olhos de células de EPR, semeie um poço de uma placa de 6 poços (passagem 0).
8. Cuidadosamente, transfira a placa de 6 poços semeada para uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% CO₂.

9. Cultivo primário de células de EPR suíno

1. Deixe as células de EPR recém-semeadas se fixarem por 48-72 h antes de mover a placa. Durante a primeira troca de meio, uma lavagem com meios de cultura de células frescos pode ser realizada para ajudar a remover o excesso de detritos celulares.
2. Substitua o meio de cultura celular a cada 48 h.
3. Quando as células atingem a confluência, faça a transição para um meio de cultura celular com uma concentração de FBS de 2% e mantenha até a experimentação.

10. Validação da célula RPE

1. Coloração imunocitoquímica (ICC)
   1. Fixar as células em formaldeído a 4% em DPBS por 10 min à temperatura ambiente.
   2. Lave duas vezes com DPBS.
   3. Permeabilizar as células (se necessário) usando Triton-X 100 a 0,2% em DPBS por 10 min à temperatura ambiente.
   4. Lave duas vezes com DPBS.
   5. Aplicar solução de bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) a 3% (p/v) em DPBS durante 1 h à temperatura ambiente.
   6. Adicionar o anticorpo primário à diluição de 1:100 (ou concentração recomendada do fabricante) (ver Tabela de Materiais) e deixar descansar durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
   7. Lave três vezes com DPBS por 5 min cada.
   8. Adicione o anticorpo secundário (se necessário) a 2 μg/mL (ou concentração recomendada do fabricante) (ver Tabela de Materiais) e deixe descansar por 1 h à temperatura ambiente.
   9. Lavar três vezes com DPBS durante 5 minutos cada se for aplicado anticorpo secundário.
   10. Adicione a sonda de coloração nuclear na concentração do fabricante (ver Tabela de Materiais) e deixe descansar por 25 minutos à temperatura ambiente.
   11. Lave três vezes com PBS por 5 min cada.
   12. Se em uma cultura de células inserir, montar na lâmina do microscópio com uma lamínula usando meio de montagem como descrito por Rickabaugh e Weatherston et ^al.20. Caso contrário, células de imagem no DPBS.
2. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
   1. Siga o procedimento descrito por Harris et ^al.21.
3. Resistência Elétrica Trans Epitelial (TEER)
   1. Seguir o protocolo do fabricante para medição TEER (ver Tabela de Materiais) com 1 mL de meio de cultura na câmara basal¹⁵.
4. Ensaio imunoenzimático (ELISA)
   1. Realizar o ELISA¹⁵ usando um kit de ensaio imunoenzimático humano multiplex seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).

Resultados

Usando este procedimento, células primárias do EPR foram isoladas com sucesso de olhos suínos. A Figura 1A mostra as células do EPR 3 dias após o isolamento com pigmentação característica. Após 1 semana de crescimento, as células estavam totalmente confluentes e formavam uma monocamada saudável (Figura 1B). As células foram então transferidas para pastilhas de cultura celular, onde mantiveram sua pigmentação e morfologia (Figu...

Discussão

Este protocolo descreve como isolar células de EPR de olhos suínos. A pigmentação e a morfologia dos paralelepípedos são observadas em até 7 dias após o isolamento (Figura 1B). Além disso, os dados TEER indicam a formação de tight junction²² e uma monocamada saudável (Figura 5). Esses resultados mostram que as células do EPR isoladas com este método são semelhantes ao EPR humano e podem ser benéficas em modelos de cultura ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody