İn Vitro Modelleme için Primer Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Özet

Bu protokol, lokal kaynaklı domuz gözlerinden primer retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin elde edilmesi ve kültürlenmesi prosedürünü özetlemektedir. Bu hücreler, kök hücrelere yüksek kaliteli bir alternatif olarak hizmet eder ve in vitro retinal araştırmalar için uygundur.

Özet

Retina pigment epiteli (RPE), dış retinada fotoreseptörleri desteklemekten sorumlu çok önemli bir tek tabakadır. RPE dejenerasyonu genellikle yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi ilerleyici görme kaybıyla kendini gösteren hastalıklarda görülür. AMD üzerine yapılan araştırmalar genellikle RPE'yi temsil etmek için insan donör gözlerine veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) dayanır. Bununla birlikte, bu RPE kaynakları, uzun farklılaşma süreleri ve kültürleme için önemli uzmanlık gerektirir. Ek olarak, bazı araştırma kurumları, özellikle kırsal alanlardakiler, donör gözlerine kolay erişimden yoksundur. Ticari olarak temin edilebilen ölümsüzleştirilmiş bir RPE hücre dizisi (ARPE-19) mevcut olsa da, temel in vivo RPE özelliklerinden yoksundur ve birçok oftalmoloji araştırma yayınında yaygın olarak kabul görmemektedir. Temsili primer RPE hücrelerini daha kolay bulunabilen ve uygun maliyetli bir kaynaktan elde etmek için acil bir ihtiyaç vardır. Bu protokol, domuz gözlerinden ölüm sonrası elde edilen ve yerel olarak ticari veya akademik tedarikçilerden temin edilebilen primer RPE hücrelerinin izolasyonunu ve alt kültürünü açıklar. Bu protokol, tipik olarak doku kültürü laboratuvarlarında bulunan ortak materyalleri gerektirir. Sonuç, iPSC'lere, insan donör gözlerine ve ARPE-19 hücrelerine birincil, farklılaştırılmış ve uygun maliyetli bir alternatiftir.

Giriş

Retina pigment epiteli (RPE), dış retinada Bruch zarı ile fotoreseptörler^{arasında bulunan bir} tek tabakadır 1. RPE hücreleri, zonula okcludens-1 (ZO-1) gibi proteinlerle sıkı bağlantılar oluşturur ve pigmentasyon ve altıgen morfoloji ^2,3 ile karakterize edilen ayırt edici bir fenotipe sahiptir. Bu hücreler kan-retina bariyerine katkıda bulunur, böylece fotoreseptör sağlığını destekler ve retina homeostazını korur ^4,5. Ek olarak, RPE hücreleri, ışığı emerek ve fotoreseptörler için gerekli bileşenleri geri dönüştürerek görmede kri....

Protokol

Bu prosedürde kullanılan gözler, USDA tarafından denetlenen yerel bir kasap dükkanından ölüm sonrası elde edilir ve canlı hayvanlar kullanılarak herhangi bir çalışma yapılmaz. Hayvanlar kurban edildikten sonra, gözler enükleasyona kadar yaklaşık 2 saat geçer. Doku çürümesi oluşmaya başlayabileceğinden, daha fazla çürümeyi önlemek için taşıma sırasında gözleri serin tutmak önemlidir. Bu prosedürde, enükleasyondan sonra gözler hemen bir buzdolabına yerleştirilir. Daha sonra, göz torbası 1000 mL'lik bir polipropilen kabın içine yerleştirilir ve 8 L'lik bir soğutucu içinde buzla çevrilidir. Gözleri doğrudan buzun üzerine koymamak önemlidir. Gözler laboratuvara geldikten s....

Tartışmalar

Bu protokol, RPE hücrelerinin domuz gözlerinden nasıl izole edileceğini açıklar. İzolasyondan sonraki 7 gün içinde pigmentasyon ve parke taşı morfolojisi görülür (Şekil 1B). Ayrıca, TEER verileri sıkı bağlantı oluşumunu²² ve sağlıklı bir tek tabakayı göstermektedir (Şekil 5). Bu sonuçlar, bu yöntemle izole edilen RPE hücrelerinin insan RPE'sine benzer olduğunu ve retina hücre kültürü modellerinde faydal?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody