İn Vitro Modelleme için Primer Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Özet

Bu protokol, lokal kaynaklı domuz gözlerinden primer retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin elde edilmesi ve kültürlenmesi prosedürünü özetlemektedir. Bu hücreler, kök hücrelere yüksek kaliteli bir alternatif olarak hizmet eder ve in vitro retinal araştırmalar için uygundur.

Özet

Retina pigment epiteli (RPE), dış retinada fotoreseptörleri desteklemekten sorumlu çok önemli bir tek tabakadır. RPE dejenerasyonu genellikle yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi ilerleyici görme kaybıyla kendini gösteren hastalıklarda görülür. AMD üzerine yapılan araştırmalar genellikle RPE'yi temsil etmek için insan donör gözlerine veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) dayanır. Bununla birlikte, bu RPE kaynakları, uzun farklılaşma süreleri ve kültürleme için önemli uzmanlık gerektirir. Ek olarak, bazı araştırma kurumları, özellikle kırsal alanlardakiler, donör gözlerine kolay erişimden yoksundur. Ticari olarak temin edilebilen ölümsüzleştirilmiş bir RPE hücre dizisi (ARPE-19) mevcut olsa da, temel in vivo RPE özelliklerinden yoksundur ve birçok oftalmoloji araştırma yayınında yaygın olarak kabul görmemektedir. Temsili primer RPE hücrelerini daha kolay bulunabilen ve uygun maliyetli bir kaynaktan elde etmek için acil bir ihtiyaç vardır. Bu protokol, domuz gözlerinden ölüm sonrası elde edilen ve yerel olarak ticari veya akademik tedarikçilerden temin edilebilen primer RPE hücrelerinin izolasyonunu ve alt kültürünü açıklar. Bu protokol, tipik olarak doku kültürü laboratuvarlarında bulunan ortak materyalleri gerektirir. Sonuç, iPSC'lere, insan donör gözlerine ve ARPE-19 hücrelerine birincil, farklılaştırılmış ve uygun maliyetli bir alternatiftir.

Giriş

Retina pigment epiteli (RPE), dış retinada Bruch zarı ile fotoreseptörler^{arasında bulunan bir} tek tabakadır 1. RPE hücreleri, zonula okcludens-1 (ZO-1) gibi proteinlerle sıkı bağlantılar oluşturur ve pigmentasyon ve altıgen morfoloji ^2,3 ile karakterize edilen ayırt edici bir fenotipe sahiptir. Bu hücreler kan-retina bariyerine katkıda bulunur, böylece fotoreseptör sağlığını destekler ve retina homeostazını korur ^4,5. Ek olarak, RPE hücreleri, ışığı emerek ve fotoreseptörler için gerekli bileşenleri geri dönüştürerek görmede kritik bir rol oynar⁶. Örneğin, RPE hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilen bir protein olan RPE65, all-trans retinil esterleri 11-cis retinol ^7,8'e dönüştürür. RPE hücreleri tarafından gerçekleştirilen çok sayıda işlev göz önüne alındığında, işlev bozuklukları yaşa bağlı makula dejenerasyonu ve diyabetik retinopati dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda rol oynar ^9,10. Retina patolojilerinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için retinanın in vitro modelleri sıklıkla kullanılmaktadır.

Sağlıklı veya hastalıklı retinaların temsili modellerini oluşturmak için, mimetik bir RPE hücre tipi kullanmak zorunludur. Ticari olarak temin edilebilen ARPE-19 hücre hattı, pigmentasyon gibi doğal fenotiplerden yoksunken, iPSC'lerin 11,12,13'ü ayırt etmesi aylar alabilir. İnsan donör gözleri ideal olsa da, çoğu araştırma laboratuvarı için genellikle hazır değildir.

Burada, birincil RPE hücrelerini elde etmek için insan gözüyle¹⁴ birçok benzerliği paylaşan domuz gözlerini kullanmak için bir yöntem geliştirdik. Bu primer domuz RPE hücreleri, çoklu retinal modellerde^{kullanılmıştır 15,16}. Bu hücreler sadece uygun maliyetli olmakla kalmaz, aynı zamanda iPSC'lerden veya donör gözlerinden daha az zaman gerektirirler. Ek olarak, pigmentasyon ve mikrovillus gibi doğal özellikler sergilerler. Domuz RPE ekstraksiyonu için benzer protokoller mevcut olsa^{da 17,18,19}, bu basit ve ayrıntılı teknik, enzimatik ayrışmayı daha da doğrular ve çoğu hücre kültürü laboratuvarında yaygın olarak bulunan malzemeleri kullanır.

Protokol

Bu prosedürde kullanılan gözler, USDA tarafından denetlenen yerel bir kasap dükkanından ölüm sonrası elde edilir ve canlı hayvanlar kullanılarak herhangi bir çalışma yapılmaz. Hayvanlar kurban edildikten sonra, gözler enükleasyona kadar yaklaşık 2 saat geçer. Doku çürümesi oluşmaya başlayabileceğinden, daha fazla çürümeyi önlemek için taşıma sırasında gözleri serin tutmak önemlidir. Bu prosedürde, enükleasyondan sonra gözler hemen bir buzdolabına yerleştirilir. Daha sonra, göz torbası 1000 mL'lik bir polipropilen kabın içine yerleştirilir ve 8 L'lik bir soğutucu içinde buzla çevrilidir. Gözleri doğrudan buzun üzerine koymamak önemlidir. Gözler laboratuvara geldikten sonra, RPE hücrelerinin izolasyonu bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilir. Bu işlemin 3-5 saat içinde tamamlanması çok önemlidir. Bu protokol 10 gözü işlemek için optimize edilmiştir.

1. DNase stok alikotlarının hazırlanması

NOT: Bu adımın izolasyondan önce gerçekleştirilmesi önerilir.

1. Steril deiyonize su ile 5 mM'lik bir kalsiyum klorür çözeltisi hazırlayın.
   DİKKAT: Kalsiyum klorür tozu ciddi göz tahrişine veya hasara neden olabilir. Uygun KKD giyin.
2. 3 mg / mL'lik bir nihai DNaz konsantrasyonu elde etmek için DNaz tozuna 5 mM kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Çözeltinin iyice karıştırıldığından emin olun.
   DİKKAT: DNaz bir solunum hassasiyeti tehlikesidir. Tozu/maddeyi solumayın.
3. Küçük hacimleri, örneğin 1 mL'yi mikrosantrifüj tüplerine ayırın.
4. Kullanana kadar alikotları -20 °C'de dondurun.

2. Diseksiyon alanının ayarlanması

1. Steril diseksiyon aletlerini ve hücre kültürü ekipmanını biyogüvenlik kabinine aktarın: cerrahi örtü, Petri kapları, hücre süzgeçleri, kuyu plakaları, gazlı bez, cımbız, neşter sapı, neşter bıçağı ve iris makası (bkz.
2. Cımbız kullanarak cerrahi örtüyü yerleştirin. Cerrahi örtünün üzerine 6 oyuklu bir plaka yerleştirin ve kapağı çıkarın.
3. Steril Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin'inden (DPBS) bir alikotu buzun üzerine ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
4. 6 oyuklu bir plakanın bir kuyusunu yarıya kadar dolu (kabaca 6 mL)% 10 povidon-iyot çözeltisi doldurun.
5. Kalan kuyuları soğutulmuş DPBS ile doldurun.
6. Petri kaplarından birinin kapağını çıkarın ve cerrahi örtünün üzerine ters çevirerek yerleştirin. Petri kabı tabanını atık kabı olarak bir kenara koyun.
7. 37 ° C'lik bir su banyosuna bir hücre kültürü ortamı (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 1 antibiyotik / antimikotik) ve% 0.25 tripsin / EDTA alikotu yerleştirin.
8. DNase stok çözeltisini dondurucudan çıkarın (daha fazla ayrıntı için protokolün geri kalanına bakın).

3. Dış doku çıkarılması

NOT: Dış doku kaldırma işlemi biyogüvenlik kabini dışında gerçekleştirilebilir. Skleranın delinmediğinden, göz bebeğinin buğulu olmadığından ve optik sinirin mevcut olduğundan emin olmak için kesmeden önce gözü inceleyin. Bu kriterlere uymayan gözleri atın.

1. Bir elinizle göze bağlı kası tutarken, diğer elinizle sklerayı çevreleyen dokuyu bir neşterle nazikçe kesmek için kullanın. Gözü ezmemeye veya yanlışlıkla sklerayı kesmemeye dikkat edin. Sklera kesilirse ve siyah iç kısmı açığa çıkarırsa, gözü atın.
   DİKKAT: Kazara kesilmelere karşı koruma sağlamak için kası tutan el için kesilmeye dayanıklı bir eldiven şiddetle tavsiye edilir.
2. Optik siniri kavisli iris makasıyla 3 mm'den büyük olmayan bir uzunluğa kesin. Optik sinir çok uzunsa, göz kabı daha sonra hücre süzgecine düzgün oturmayacaktır.
3. Gözü kornea aşağı bakacak şekilde buzun üzerine yerleştirin.
4. Her bir gözden dış doku çıkarılana kadar 3.1-3.3 adımlarını tekrarlayın.

4. Göz diseksiyonu

1. Bir gözü biyogüvenlik kabinine ve %10 povidon-iyot çözeltisi içeren kuyuya aktarmak için cımbız kullanın ve iyot çözeltisiyle tamamen kaplandığından emin olmak için gözü döndürün. Aletleri mümkün olduğunca steril tutmak için bu cımbız sadece gözün dışına dokunmak için kullanılmalıdır.
2. Göz iyot çözeltisinde otururken, daha önce hazırlanan Petri kabının sığ, ters çevrilmiş kapağına steril bir gazlı bez yerleştirin. Ayrı bir Petri kabına bir hücre süzgeci yerleştirin. Hücre süzgecini yalnızca göz kapağını desteklemek için kullanın, hücre ayrımı için değil.
3. Gözün iyot çözeltisinde yaklaşık 30 saniye oturmasına izin verdikten sonra, gözü DPBS içeren kuyucuklara her biri yaklaşık 5 saniye daldırarak yıkayın, iyot çözeltisini aşamalı olarak seyreltmek için kuyudan kuyuya hareket edin ve gözü steril gazlı beze aktarın.
4. Ora serrata'nın altında bir neşter kullanarak veya iris kenarından kürenin kabaca 1/3'ü kadar küçük bir kesi yapın.
5. Kesi işleminin ardından, korneaya paralel olarak dünyanın çevresi boyunca eşit şekilde kesmek için iris makası kullanın. Gözü hareket ettirirken, steriliteyi korumak için sadece gözün dışına veya gazlı beze dokunmak için cımbız kullanın.
6. Optik siniri tutmak için cımbız kullanın ve küreyi gazlı bezden yavaşça kaldırın. Vitreus dünyadan düşmelidir. Gerekirse, vitreusun yerinden çıkmasına yardımcı olmak için gözü hafifçe sallayın.
   NOT: Vitreusun çıkarılması çok zorsa, küreyi daha alçaktan kesmeyi deneyin.
7. Göz kabını, göz kabının içi yukarı bakacak şekilde hazırlanan hücre süzgecine nazikçe yerleştirin. Düzensizse, kesiği mümkün olduğunca düz hale getirmek için göz kabını ayarlamak için cımbız kullanın.
8. Soğutulmuş DPBS'yi göz kabına nazikçe ekleyin, böylece sıvı seviyesi insizyonun en alt noktasının hemen altında olur. Bu DPBS, nöral retinanın çıkarılmasının ardından çıkarılacaktır.
   NOT: Eklenen DPBS hacmi, göz boyutuna ve insizyon konumuna bağlı olarak değişecektir.
9. Tüm gözler diseke edilene kadar 4.1-4.8 adımlarını tekrarlayın.

5. Nöral retinanın çıkarılması ve RPE ayrışması

NOT: Aşağıdaki bölümün aşamalar halinde gerçekleştirilmesi daha kolaydır. Bu kurulumda, bu işlem bir seferde bir parti (genellikle 3 göz kabı) üzerinde gerçekleştirilir. 5.1-5.7 arasındaki adımlar için, bir sonraki adıma geçmeden önce her adım tüm partide gerçekleştirilmelidir.

1. Bir el feneri altında, nöral retinanın (beyaz/pembe) RPE'den (siyah) ayrılmaya başladığı alanları bulun. Ardından, kaldırılan nöral retinayı nazikçe tutmak ve soymak için künt cımbız kullanın.
   NOT: Nöral retinanın ayrıldığı alan yoksa, göz kabının üst kısmına yakın bir yerden nazikçe tutmak için cımbız kullanın. Bu yöntemi kullanarak, RPE / koroide zarar verilirse, bu hücreler RPE toplanması sırasında ayrışmayacaktır.
2. Nöral retinayı optik diskin yakınında nazikçe toplayın.
3. Vakum aspirasyon sistemine bağlı bir Pasteur pipeti kullanarak nöral retinayı aspire edin. Çıkarma işlemine yardımcı olması için aspirasyonun yumuşatılması önerilir.
   NOT: Emmeyi azaltmak için Pasteur pipetinin ucuna bir pipet ucu yerleştirilebilir.
4. Aspire edileni değiştirmek için dikkatlice ek soğutulmuş DPBS ekleyin.
5. Kalan nöral retinayı bir kez daha aspire ederek çıkarın. Bu sefer, açıkta kalan RPE'yi rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla DPBS'yi çıkarın.
6. Göz kabına yavaşça tripsin ekleyin. Kontaminasyonu azaltmak için ses seviyesini insizyon hattının ve hasarlı RPE'nin herhangi bir bölümünün altında tutun.
   DİKKAT: Tripsin, temas halinde cilt ve göz tahrişine neden olacak bir enzimdir. Uygun KKD giyin.
7. Her göze tripsin eklendikten sonra, Petri kabı kapağının değiştirildiğinden emin olun. Daha sonra, Petri kabını 30 dakika boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın.
8. Tüm göz kapakları işlenene kadar her parti için 5.1-5.7 adımlarını tekrarlayın.

6. RPE koleksiyonu

1. Her bir göz grubundan (2-3 göz) RPE hücrelerini toplayın ve tohumlama işlemini kolaylaştırmak için tek bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
   1. Bir el feneri altında, RPE hücrelerini yerinden çıkarmak için 1000 μL'lik bir pipet kullanarak hafifçe ezin. RPE hücreleri ayrılmıyorsa, taze tripsin ekleyin ve 10-15 dakika daha inkübe edin. Retinayı kazımamaya dikkat edin.
   2. RPE hücrelerini 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
   3. Kalan hücreleri toplamak ve tripsini nötralize etmek için göz kapağını hücre kültürü ortamıyla yıkayın. 15 mL santrifüj tüpünde tripsin için en az iki kat daha fazla ortam olduğundan emin olun.
2. Tüm göz kapaklarından RPE hücreleri toplanana kadar adım 6.1'i tekrarlayın.
3. Hücre süspansiyonlarını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin.

7. DNase çalışma çözümünün hazırlanması

1. 100 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon ve hücre tüpü başına 3 mL'lik son hacim için hücre kültürü ortamına eklemek için gereken 3 mg/mL DNaz stok çözeltisinin (1. adımda hazırlanır) hacmini hesaplayın (yani, üç santrifüj tüpü için hücreler, 9 mL 100 μg/mL DNaz çözeltisi gereklidir).
2. Uygun hacimlerde DNaz stok çözeltisini ve hücre kültürü ortamını birleştirin. Çalışma solüsyonunda DNaz kullanılması, hücre topaklanmasını önlemeye yardımcı olur ve hücrelerin eşit şekilde tohumlanmasını sağlar.

8. RPE hücre tohumlama

1. Adım 6.3'teki santrifüjlemeyi takiben, hücre peletini bozmamaya dikkat ederek her 15 mL'lik santrifüj tüpünden süpernatanları çıkarın.
2. Her hücre peletini 3 mL DNaz çalışma solüsyonunda yeniden süspanse edin.
3. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri içeren 15 mL'lik santrifüj tüplerini 37 ° C'de ve 15 dakika boyunca% 5 CO_2'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
4. İnkübasyonun ardından, hücre süspansiyonlarını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyin.
5. Hücre peletlerini bozmamaya dikkat ederek süpernatantları çıkarın.
6. Her hücre peletini 3 mL taze hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin.
7. 2-3 göz değerinde RPE hücresi içeren her santrifüj tüpü için, 6 oyuklu bir plakadan bir kuyu tohumlayın (pasaj 0).
8. Dikkatlice, tohumlanmış 6 oyuklu plakayı 37 ° C ve% 5 CO_2'de nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın.

9. Birincil domuz RPE hücre kültürü

1. Plakayı hareket ettirmeden önce yeni tohumlanmış RPE hücrelerinin 48-72 saat bağlanmasına izin verin. İlk ortam değişimi sırasında, fazla hücre kalıntılarının giderilmesine yardımcı olmak için taze hücre kültürü ortamı ile yıkama yapılabilir.
2. Hücre kültürü ortamını her 48 saatte bir değiştirin.
3. Hücreler birleştiğinde, FBS konsantrasyonu %2 olan bir hücre kültürü ortamına geçin ve deneye kadar devam edin.

10. RPE hücre doğrulaması

1. İmmünositokimyasal (ICC) boyama
   1. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DPBS'de% 4 formaldehit içinde sabitleyin.
   2. DPBS ile iki kez yıkayın.
   3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DPBS'de% 0.2 Triton-X 100 kullanarak hücreleri (gerekirse) geçirgenleştirin.
   4. DPBS ile iki kez yıkayın.
   5. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca DPBS'de% 3 (a / h) sığır serum albümini (BSA) bloke edici solüsyon uygulayın.
   6. 1:100 seyreltmede (veya önerilen üretici konsantrasyonunda) birincil antikor ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de bekletin.
   7. DPBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   8. İkincil antikor (gerekirse) 2 μg/mL'de (veya önerilen üretici konsantrasyonunda) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
   9. İkincil antikor uygulanırsa, her biri 5 dakika boyunca DPBS ile üç kez yıkayın.
   10. Üreticinin konsantrasyonunda nükleer boyama probu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve oda sıcaklığında 25 dakika bekletin.
   11. PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   12. Bir hücre kültürü ekindeyse, Rickabaugh ve Weatherston ve ^ark.20 tarafından belirtildiği gibi montaj ortamı kullanarak bir lamel ile mikroskop lamına monte edin. Aksi takdirde, DPBS'deki görüntü hücreleri.
2. Taramalı elektron mikroskobu (SEM)
   1. Harris ve ^ark.21 tarafından özetlenen prosedürü izleyin.
3. Trans Epitelyal Elektrik Direnci (TEER)
   1. Bazal odada 1 mL kültür ortamı ile TEER ölçümü için üreticinin protokolünü izleyin (Malzeme Tablosuna bakın)¹⁵.
4. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA)
   1. ELISA^15'i, üreticinin protokolünü izleyerek multipleks bir insan enzimine bağlı immünosorbent test kiti kullanarak gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).

Sonuçlar

Bu prosedür kullanılarak, primer RPE hücreleri domuz gözlerinden başarılı bir şekilde izole edildi. Şekil 1A , karakteristik pigmentasyon ile izolasyondan 3 gün sonra RPE hücrelerini göstermektedir. 1 haftalık büyümeden sonra, hücreler tamamen birleşti ve sağlıklı bir tek tabaka oluşturdu (Şekil 1B). Hücreler daha sonra pigmentasyonlarını ve morfolojilerini korudukları hücre kültürü eklerine aktarıldı (Şekil ...

Tartışmalar

Bu protokol, RPE hücrelerinin domuz gözlerinden nasıl izole edileceğini açıklar. İzolasyondan sonraki 7 gün içinde pigmentasyon ve parke taşı morfolojisi görülür (Şekil 1B). Ayrıca, TEER verileri sıkı bağlantı oluşumunu²² ve sağlıklı bir tek tabakayı göstermektedir (Şekil 5). Bu sonuçlar, bu yöntemle izole edilen RPE hücrelerinin insan RPE'sine benzer olduğunu ve retina hücre kültürü modellerinde faydal?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody