重复缺血导致冠状动脉侧支生长的小鼠模型

摘要

本文提出了一种研究小鼠重复性缺血诱导的产后冠状动脉侧支生长的方法，包括在左前降支动脉上手术植入气动封堵器、用于重复性缺血方案的自动充气系统，以及评估侧支生长的潜在方法。

摘要

冠状动脉侧支神经是缺血性心脏病 （IHD） 的自然旁路，因此多年来，冠状动脉侧支生长 （CCG） 一直是 IHD 的一个有前途的治疗靶点，特别是对于 2 型糖尿病或 CCG 受损的代谢综合征患者。然而，这个过程研究不足，部分原因是缺乏 CCG 的小鼠模型，即使已经建立了其他动物模型，如猪、狗和大鼠。小鼠模型可以利用该物种可用的许多基因修饰，包括谱系追踪和基因调控（过表达或敲除），来阐明 CCG 的过程和机制，包括所涉及的通路和细胞类型。因此，我们着手开发一种由重复缺血 （RI） 通过瞬时、 左前降支 （LAD） 的重复闭塞。本手稿提供了该小鼠 CCG 模型的详细信息，包括在 LAD 上植入气动封堵器的 RI 手术、用于控制充气压力和时间的基于压力的自动充气系统，以及 RI 协议的顺序。这种方法已经产生了一篇出版物来阐明 RI 诱导的 CCG 过程，表明发芽血管生成在成年小鼠心脏的 CCG 中产生成熟的冠状动脉。

引言

缺血性心脏病 （IHD） 是美国导致死亡的主要原因，每年进行超过 200,000 例冠状动脉搭桥手术来治疗这种疾病¹。冠状动脉侧支，冠状动脉树分支之间的吻合口，是一种天然旁路，可以向阻塞下游的缺血组织供血²;然而，人们在其原生抵押网络的范围上表现出很大差异 ^3,4。冠状动脉侧支循环更广泛的 IHD 患者在心脏事件期间预后更好，包括梗死面积和死亡率降低。因此，冠状动脉侧支生长 （CCG） 十多年来一直是治疗靶点 ^5,6,7。对于越来越多的代谢综合征⁸ 患者来说，这一点特别有趣，他们表现出较差的冠状动脉侧支平衡⁹ （coronary collateralization）。然而，在更好地了解 CCG 的过程和机制之前，尝试诱导 CCG 治疗 IHD 不太可能取得成果。

已在大型动物模型中研究了冠状动脉侧支，并且已使用冠状动脉主动脉的短暂、重复闭塞来诱导猪¹⁰、狗¹¹ 和大鼠¹² 的 CCG。然而，CCG 的小鼠模型在研究 CCG 的分子和细胞机制方面将具有更多优势，因为有许多现成的转基因小鼠品系，包括谱系示踪、基因特异性或细胞特异性转基因和敲除品系。有趣的是，与人类不同，据报道小鼠没有天然冠状动脉侧支^13,14，^这使它们成为研究冠状动脉侧支形成的有吸引力的模型。事实上，最近的一份报告显示，在阻塞性动脉疾病患者中，近一半 （47%） 没有侧支循环（Rentrop 0 级）³;因此，CCG 的小鼠模型可能与天然侧支最小的患者具有临床相关性。

因此，我们开发了一种由重复缺血诱导的 CCG 小鼠模型，在左前降支 （LAD） 上有一个充气球囊封堵器，该封堵器使用基于压力的充气系统，该系统由计时器自动完成。重复缺血方案能够刺激侧支生长，如最近的出版物¹⁴ 所示。这种 CCG 小鼠模型将为细胞和分子水平的 CCG 过程提供新的见解，并可用于验证促进 CCG 的潜在靶点。

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研究方案

所描述的动物实验是根据实验动物护理和使用指南进行的，并得到了东北俄亥俄医科大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 手术准备

注：对于 RI 方案，使用体重至少 25 g 的任一性别的 C57BL/6 小鼠。在整个手术过程中使用无菌技术。

1. 设置
   1. 在高压灭菌器或微珠灭菌器中对所有工具进行灭菌。使用环氧乙烷 （EtO） 对精密材料和植入物进行消毒，例如封堵器、系绳和 PE 管。
   2. 用 70% 乙醇擦拭所有区域，清洁手术区域。将所有工具和用品放在无菌窗帘上，准备该区域。有关耗材的完整列表，请参阅 材料表 。
2. 小鼠插管
   1. 用 3% 异氟醚和氧气（1 L/min 流速）短暂麻醉小鼠，直到扶正反射消失。剃掉胸部区域、背部中央和右耳后面;完全去除松散的头发。以 0.01-0.02 mg/kg 的剂量肌肉注射格隆溴铵。
   2. 再次用 3%-4% 异氟醚麻醉 5 分钟。将鼠标仰卧在斜坡上，远离其上切牙，并使用钝镊子将舌头移到一边。使用光纤灯和放大喉镜，用 20G 血管导管快速插管小鼠。
   3. 将小鼠仰卧在加热的手术垫上，并将插管连接到含有 3% 异氟醚的小动物呼吸机上。通过检查有无节律性双侧胸部起伏来确认插管。通过缺乏脚趾捏反应来确认足够的麻醉深度。
3. 手术区域的准备
   1. 将眼药膏涂抹在眼睛上以防止干燥。
   2. 用 betadine 和 70% 乙醇清洁剃须区域，单向擦拭一次。
   3. 将电极霜涂抹在手术垫上的心电图 （EKG） 触点上，并将鼠标的四肢贴在上面。将无菌纱布覆盖在小鼠的下半部分。
   4. 使用手术垫的软件界面在手术过程中监测呼吸频率、温度和麻醉深度。
4. 左开胸手术和封堵器植入术
   1. 将异氟醚降低至 2%。用剪刀在胸部皮肤上做一个 2-3 厘米的中线切口，然后用弯曲的镊子轻轻分离胸部左侧的皮肤和肌肉层（图 1A）。
   2. 使用钝镊子，轻轻地在胸壁上开一个口，露出心脏，通常在第 3 和第 5^肋间之间。
   3. 使用牵开器轻轻张开肋骨并观察心脏。使用钝钳撕开心包，露出心脏。如果可能，找到左耳廓（图 1B）并可视化左前降支 （LAD） 的基底部分。
   4. 过一个 8-0聚丙烯缝合线穿过 LAD 下方的心肌。
      注意： 入口和出口之间的距离应大约等于遮挡物的宽度，并垂直于 LAD。
   5. 拆下牵开器。使用尖头镊子，将封堵管的末端穿过第二肋下间隙的胸壁，并通过胸壁将封堵管拉出，直到封堵管位于胸腔中的心脏上方。
   6. 使用外科医生结将封堵器牢固地系在心脏上（图 1C），使封堵器位于心脏上，但不会压入心脏。
   7. 使用按钮充气装置以 10 psi 的速度短暂充气封堵物（~10 秒）（图 2）。检查心电图以确认充气期间 ST 段抬高，如果可能，目测确认心尖变白。根据需要调整缝合线的位置或张力以确认缺血。
5. 关闭
   1. 用 6-0 聚丙烯缝合线闭合侧肋，插入胸管。排空胸部的空气和血液，然后取出胸管。将 2% 利多卡因涂抹在胸壁的闭合切口上。
   2. 使用尖头镊子，将封堵管钻入右肩皮肤下，以将管子穿过右耳后面的皮肤。更换胸部肌肉并用 6-0 聚乳蛋白缝合线闭合皮肤（图 1D）。
   3. 将鼠标翻转到俯卧位置。手术结束前至少 30 分钟以 3 mg/kg 的剂量皮下注射酮洛芬（使用 1 mg/mL 稀释在 0.9% 无菌盐水中）。
6. 系绳植入术
   1. 使用小剪刀在背部中央的皮肤上切开一个小 （1 cm） 切口，然后轻轻地将皮肤与皮下脂肪和肌肉组织分开。
   2. 将封堵管隧道连接到背部中心的切口，将其向外侧，然后将其穿过系绳。使用 6-0 缝合线闭合耳朵附近的小孔。
   3. 使用 6-0 聚丙烯缝合线将系绳固定到背部肌肉上（图 1E）。用 6-0 缝合线闭合系绳按钮上的皮肤。
7. 恢复
   1. 一旦小鼠可以独立呼吸，请取出插管;将小鼠置于术后 RI 笼中（对于单个动物; 图 3）一旦 foot pinch 响应返回。持续监测小鼠，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。将笼子放在加热垫上，直到鼠标恢复完全活动。
   2. 第二天，以 3 mg/kg 的剂量皮下注射第二剂酮洛芬。
   3. 在开始 RI 协议之前，让鼠标休息 5-7 天。每天监测小鼠仪器的完整性，并根据需要更换笼子。根据需要提供适当的富集，因为在 RI 方案期间，小鼠是单舍的。

2. 重复性缺血

1. 如¹⁵ 所述，在 RI 方案的第 0 天通过超声心动图检查封堵物的位置。观察封堵器充气期间心脏功能的下降。
2. 将鼠标的封堵管连接到 RI 充气系统（图 4）。系统将封堵器充气至 10 psi，持续 6 分钟，每天 4 次，每次充气之间有 3 小时的休息时间（图 5）。
3. RI 17 天后，按照步骤 2.1 重新检查心脏功能。

3. 聚合物灌注和组织收获

1. 在处死时，用 3%-4% 异氟醚麻醉小鼠并腹膜内注射肝素 （500 U/kg）。使用鼻锥继续以 2% 的异氟醚给药至少 5 分钟，然后通过缺乏脚趾捏反应来确认足够的麻醉深度。
2. 打开胸腔，露出心脏和胸主动脉。用 PE20 管套管胸降主动脉，并平除下腔静脉 （IVC） 以允许流出;用 1x PBS 逆灌心脏，直到流出 IVC 的液体清澈，然后加入 3 mL 1% 利多卡因，然后加入 3 mL 4% 多聚甲醛 （PFA） 的 PBS 溶液。在封堵物的确切位置永久结扎 LAD。
3. 用不透射线的试剂逆行灌注心脏，直到动脉回路充满。用止血钳夹住 PE20 管，让聚合物固化 90 分钟。在解剖镜下对心脏进行成像。

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结果

在 136 只 C57BL/6 小鼠（包括雄性和雌性）中，RI 手术的存活率为 93.4%，其中 80.9% 的小鼠在整个 17 天的 RI 方案中存活。

小鼠 RI 方案基于以前的动物 RI 模型^12,16 进行了优化，该模型具有短暂的缺血发作，不会对心肌造成永久性损伤。在手术过程中，可以通过观察封堵器充气期间 LV 心尖的可见褪白和心电图上...

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讨论

冠状动脉侧支支管是 IHD 患者的天然旁路手术。在针对血管生成¹⁷ 的临床试验失败后，促进冠状动脉侧支发育可能是这些患者更好的治疗方法。与血管生成来源的毛细血管不同，毛细血管只有单层内皮细胞，侧支神经是覆盖平滑肌细胞的成熟动脉。侧支循环将血流再供应到阻塞性动脉引起的心肌缺血区域。了解 CCG 的调节对于开发治疗 IHD 的新靶点至关重...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 degree forceps	Fine Science Tools	11251-35
1/4" Closed Brass Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS2-00054	inflation system
1/4" Open Brass Electric Solenoid Valve	AceCrew		inflation system
1/4" pneumatic tubing	‎China SNS Pneumatic Co.,Ltd	‎APU1/4-32.8ft	push-button device
1/4" push-in connectors	RuoFeng	543Y	push-button device
1/8" brass fittings	Edge Industrial		inflation system
2 Position Pneumatic Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS- PSV00033	push-button device
20G angiocath	BD	381703
45 degree Castroviejo needle holders	Roboz	RS-6421
6-0 polyglactin sutures	DemeTECH	G176011B13M
6-0 polypropylene sutures	AD Sugical	XS-P618R11
70% Ethanol
8-0 polypropylene sutures	DemeTECH	PM19800, 65G0P
Betadine	Purdue Products	367618150085
Blunt nosed scissors	World Precision Intruments	500366
Carbon fiber arrow shaft			post-surgical cage; cut to 12.5 cm
Cotton swabs (3")	Puritan	872-PC DBL
Curity Gauze Sponges (2x2)	Cardinal Health	2146
Dipsey swivel sinkers	Water Gremlin		post-surgical cage
Electrode cream	Signacreme	17-05
Glycopyrrolate	Westward	0143-9679-01
Hartman hemostats	Fine Science Tools	13003-10
Isoflurane	Covetrus	29404
Ketofen (ketoprofen)	zoetis	10004031
Lidocaine (2%)	Covetrus	14583
MICROFIL (yellow)	Flow Tek	MV-122
Mini Push Button	Interactivia	E-SWC-PBM-PBS-105	push-button device
Miniature Air Pressure Regulator	PneumaticPlus	PPR2-N02BG-4	push-button device
Mini-Colibri spring retractor	Fine Science Tools	17000-01
MiniVent ventilator	Harvard Apparatus	73-0044
Occluder			Custom made
Octagon handled forceps	Fine Science Tools	11041-08
Ohan Rodent Intubation System	BMR Supply	Ohan-201
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz	sc-281692
PE20 tubing
PE50 tubing
Plastic swivel (1 channel)	Instech	375/25PS	post-surgical cage
Premixed PBS Buffer, 10x	Roche	11666789001	Diluted to 1x
Pressure Gauge	PIC Gauges	102D-158D-10/32	push-button device
Programmable Digital Outlet Timer	BN-LINK	‎BND-60/SU105	inflation system
Puralube Vet Opthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38
Retractors w/ 18200-07 elastomer	Fine Science Tools	18200-10 and 18200-11
Rodent Surgical Monitor+	Scintica	900-0053-01
Round handled suture tying forceps	Fine Science Tools	18026-10
Snap-lock barrel swivel (size 5)	Eagle Claw	‎01032-005	post-surgical cage
Straight needle holders	Fine Science Tools	12060-01
Tether	Instech	PS62