JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, farelerde tekrarlayan iskeminin neden olduğu doğum sonrası koroner kollateral büyümeyi incelemek için sol ön inen arterde pnömatik bir tıkayıcının cerrahi implantasyonu, tekrarlayan iskemi protokolü için otomatik bir şişirme sistemi ve kollateral büyümeyi değerlendirmek için potansiyel yöntemler dahil olmak üzere bir yöntem sunmaktadır.

Özet

Koroner kollateraller, iskemik kalp hastalıklarında (İBH) doğal bir baypastır ve bu nedenle uzun yıllar boyunca, koroner kollateral büyüme (CCG), özellikle CCG'nin bozulduğu tip 2 diyabet veya metabolik sendromlu hastalarda İHD için umut verici bir terapötik hedef olmuştur. Bununla birlikte, bu süreç, domuzlar, köpekler ve sıçanlar gibi diğer hayvan modelleri kurulmuş olsa da, kısmen CCG'nin fare modellerinin eksikliğinden dolayı yeterince çalışılmamıştır. Bir fare modeli, ilgili yollar ve hücre tipleri de dahil olmak üzere CCG'nin sürecini ve mekanizmasını aydınlatmak için soy izleme ve gen düzenlemesi (aşırı ekspresyon veya nakavt) dahil olmak üzere türler için mevcut olan birçok genetik modifikasyondan yararlanabilir. Bu nedenle, geçici olarak tekrarlayan iskemi (RI) tarafından indüklenen bir CCG fare modeli geliştirmek için yola çıktık, sol ön inen arterin (LAD) tekrarlayan oklüzyonu. Bu el yazması, LAD'ye pnömatik bir tıkayıcı implante etmek için RI ameliyatı, şişirmenin basıncını ve zamanlamasını kontrol etmek için kullanılan otomatik basınca dayalı şişirme sistemi ve RI protokolünün sırası dahil olmak üzere bu fare CCG modelinin ayrıntılarını sağlar. Bu yöntem, RI tarafından indüklenen CCG sürecini aydınlatmak için zaten bir yayın oluşturmuştur ve filizlenen anjiyogenezin yetişkin fare kalplerinde CCG'de olgun koroner arterlere yol açtığını göstermektedir.

Giriş

İskemik kalp hastalığı (IHD), Amerika Birleşik Devletleri'nde önde gelen mortalite nedenidir ve hastalığı tedavi etmek amacıyla yılda 200.000'den fazla koroner arter baypas ameliyatı yapılmaktadır1. Koroner kollateraller, koroner arter ağacının dalları arasındaki anastomozlar, bir blokaj2'nin aşağısındaki iskemik dokuya kan sağlayabilen doğal bir baypastır; Bununla birlikte, insanlar yerel teminat ağlarının kapsamında geniş bir çeşitlilik göstermektedir 3,4. Daha geniş koroner kollateralizasyonu olan İBH'li hastalar, kardiyak olaylar sırasında azaltılmış enfarktüs boyutu ve mortalite dahil olmak üzere daha iyi sonuçlara sahiptir. Bu nedenle, koroner kollateral büyüme (CCG) on yıldan fazla bir süredir terapötik bir hedef olmuştur 5,6,7. Daha zayıf koroner kollateralizasyon9 sergileyen metabolik sendromlu8 hastaların artan sayısı için özellikle ilgi çekicidir. Bununla birlikte, CCG'nin süreci ve mekanizması daha iyi anlaşılana kadar, İBH tedavisi için CCG'yi indüklemeye çalışmanın verimli olması olası değildir.

Koroner kollateraller büyük hayvan modellerinde incelenmiştir ve ana koroner arterlerin kısa, tekrarlayan tıkanıklıkları domuzlarda10, köpeklerde11 ve sıçanlarda12 CCG'yi indüklemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bir CCG fare modeli, soy izleme, gene özgü veya hücreye özgü transgenik ve nakavt hatları dahil olmak üzere kolayca bulunabilen birçok genetik olarak değiştirilmiş fare hattı nedeniyle CCG'nin moleküler ve hücresel mekanizmalarını incelemede daha fazla avantaja sahip olacaktır. İlginç bir şekilde, insanlardan farklı olarak, farelerin doğal koroner teminatlarasahip olmadığı bildirilmektedir 13,14, bu da onları koroner kollateral oluşumunu incelemek için çekici bir model haline getirmektedir. Nitekim, yakın tarihli bir rapor, obstrüktif arter hastalığı olan hastaların yaklaşık yarısının (%47) teminatlandırma olmadığını göstermiştir (Rentrop derece 0)3; bu nedenle, bir CCG fare modeli, minimal doğal kollateralizasyonu olan hastalar için klinik olarak anlamlı olabilir.

Bu nedenle, bir zamanlayıcı ile otomatikleştirilmiş basınca dayalı bir şişirme sistemi kullanan sol ön inen arter (LAD) üzerinde şişirilebilir bir balon tıkayıcı ile tekrarlayan iskemi tarafından indüklenen bir CCG fare modeli geliştirdik. Tekrarlayan iskemi protokolü, yakın tarihli bir yayındagösterildiği gibi kollateral büyümeyi uyarabilir 14. CCG'nin bu fare modeli, hücresel ve moleküler seviyelerde CCG sürecine yeni bir bakış açısı sağlayacaktır ve CCG'yi teşvik etmek için potansiyel hedefleri doğrulamak için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Açıklanan hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüş ve Kuzeydoğu Ohio Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Cerrahi hazırlık

NOT: RI protokolü için, her iki cinsiyetten en az 25 g ağırlığında C57BL/6 fare kullanın. Ameliyat boyunca aseptik teknik kullanın.

  1. Kurulum
    1. Tüm aletleri bir otoklav veya boncuk sterilizatöründe sterilize edin. Tıkayıcı, ip ve PE boru gibi hassas malzemeleri ve implantları etilen oksit (EtO) ile sterilize edin.
    2. Tüm alanları %70 etanol ile silerek ameliyat bölgesini temizleyiniz. Tüm alet ve malzemeleri steril örtüler üzerine yerleştirerek alanı hazırlayın. Sarf malzemelerinin tam listesi için Malzeme Tablosuna bakın.
  2. Fare entübasyonu
    1. Fareyi% 3 izofluran ile oksijenli (1 L / dak akış hızı) doğru refleks kaybolana kadar kısaca uyuşturun. Göğüs bölgesini, sırtın merkezini ve sağ kulağın arkasını tıraş edin; Gevşek saçları tamamen çıkarın. Glikopirrolatı kas içine 0.01-0.02 mg / kg enjekte edin.
    2. 5 dakika boyunca% 3 -% 4 izofluran ile tekrar uyuşturun. Fareyi sırtüstü yatırın, üst kesici dişlerinden tutun ve dili kenara çekmek için körelmiş forseps kullanın. Fiber optik ışık ve büyüteçli bir laringoskop kullanarak fareyi 20 G'lik bir anjiyokatla hızlı bir şekilde entübe edin.
    3. Fareyi ısınan bir cerrahi ped üzerine sırtüstü yatırın ve entübasyon tüpünü %3 izofluran içeren küçük bir hayvan ventilatörüne bağlayın. Ritmik bilateral göğüs yükselmesini kontrol ederek entübasyonu onaylayın. Ayak parmağı sıkışma tepkisi eksikliği ile yeterli anestezi derinliğini onaylayın.
  3. Cerrahi alanın hazırlanması
    1. Kurumayı önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.
    2. Traş edilen bölgeleri betadin ve ardından %70 etanol ile tek yönlü bir şekilde bir kez silerek temizleyin.
    3. Cerrahi ped üzerindeki elektrokardiyogram (EKG) temas noktalarına elektrot kremi sürün ve farenin uzuvlarını bunlara bantlayın. Farenin alt yarısının üzerine steril gazlı bez örtün.
    4. Cerrahi pedin yazılım arayüzünü kullanarak ameliyat boyunca solunum hızını, sıcaklığı ve anestezi derinliğini izleyin.
  4. Sol torakotomi ve oklüder implantasyonu
    1. İzofluranı% 2'ye düşürün. Makas kullanarak göğüste ciltte 2-3 cm'lik bir orta hat kesisi yapın, ardından göğsün sol tarafındaki cilt ve kas tabakalarını nazikçe ayırmak için kavisli forseps kullanın (Şekil 1A).
    2. Körelmiş forseps kullanarak, kalbi ortaya çıkarmak için göğüs duvarından nazikçe bir açıklık açın, tipik olarak 3. ve 5. interkostaller arasında.
    3. Kaburgaları nazikçe açmak ve kalbi görselleştirmek için bir ekartör kullanın. Künt forseps kullanarak, kalbi açığa çıkarmak için perikardımı yırtın. Sol kulak kepçesini bulun (Şekil 1B) ve mümkünse sol ön inen arterin (LAD) bazal kısmını görselleştirin.
    4. 8-0'ı geç LAD'ın altındaki miyokarddan polipropilen sütür.
      NOT: Giriş ve çıkış arasındaki mesafe, tıkayıcının genişliğine yaklaşık olarak eşit ve LAD'ye dik olmalıdır.
    5. Ekartörleri çıkarın. Sivri forsepsler kullanarak, tıkayıcı tüpün ucunu ikinci inferior interkostal boşlukta göğüs duvarından dışarı çıkarın ve tıkayıcı tüpü, tıkayıcı göğüs boşluğunda kalbin üzerine yerleşene kadar göğüs duvarından dışarı çekin.
    6. Bir cerrah düğümü kullanarak oklüderi kalbe güvenli bir şekilde bağlayın (Şekil 1C), böylece tıkayıcı kalbin üzerine uzanır ancak içine bastırmaz.
    7. Buton şişirme cihazını kullanarak tıkayıcıyı (~ 10 s) 10 psi'de kısaca şişirin (Şekil 2). Şişirme sırasında ST yüksekliğini doğrulamak için EKG'yi kontrol edin ve mümkünse kalp tepesinin beyazlamasını görsel olarak onaylayın. İskemiyi doğrulamak için sütürün konumunu veya gerginliğini gerektiği gibi ayarlayın.
  5. Kapanış
    1. Göğüs tüpünü yerleştirerek yan kaburgaları 6-0 polipropilen sütür ile kapatın. Göğüsteki havayı ve kanı boşaltın, ardından göğüs tüpünü çıkarın. Göğüs duvarındaki kapalı kesiye% 2 lidokain uygulayın.
    2. Sivri forseps kullanarak, boruyu sağ kulağın arkasındaki deriden dışa çıkarmak için tıkayıcı boruyu sağ omzun derisinin altına tünelleyin. Göğüs kaslarını değiştirin ve cildi 6-0 poliglaktin sütür ile kapatın (Şekil 1D).
    3. Fareyi yüzüstü konuma çevirin. Ameliyatın bitiminden en az 30 dakika önce ketoprofen'i 3 mg / kg'lık bir dozda (% 0.9 steril salin içinde 1 mg / mL seyreltme kullanarak) deri altından uygulayın.
  6. Tether implantasyonu
    1. Küçük bir makas kullanarak sırtın ortasındaki cilt üzerinde küçük (1 cm) bir kesi yapın ve cildi cilt altı yağ ve kas dokusundan nazikçe ayırın.
    2. Tıkayıcı boruyu sırtın ortasındaki kesiye tünelleyin, dışını dışa çıkarın ve ipten geçirin. Kulağın yanındaki küçük deliği kapatmak için 6-0 dikiş kullanın.
    3. Ipi sırt kaslarına sabitlemek için 6-0 polipropilen sütürler kullanın (Şekil 1E). 6-0 dikişlerle cildi bağlama düğmesinin üzerinden kapatın.
  7. Kurtarma
    1. Fare bağımsız olarak nefes alabildiğinde entübasyon tüpünü çıkarın; fareyi ameliyat sonrası bir RI kafesine yerleştirin (tek bir hayvan için; Şekil 3) ayak sıkışması tepkisi geri döndüğünde. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi sürekli olarak izleyin. Fare tam hareket kabiliyetini geri kazanana kadar kafesi bir ısı yastığının üzerine yerleştirin.
    2. Ertesi gün, deri altına 3 mg / kg'da ikinci bir ketoprofen dozu uygulayın.
    3. RI protokolüne başlamadan önce farenin 5-7 gün dinlenmesine izin verin. Enstrümantasyonun bütünlüğü için fareleri günlük olarak izleyin ve gerektiğinde kafesleri değiştirin. Fareler, RI protokolü süresince tek başına barındırıldığından, gerektiğinde uygun zenginleştirme sağlayın.

2. Tekrarlayan iskemi

  1. Daha önce tarif edildiği gibi, RI protokolünün 0. gününde ekokardiyografi ile oklüderin yerleşimini kontrol edin15. Oklüderin şişirilmesi sırasında kardiyak fonksiyondaki azalmayı gözlemleyin.
  2. Farenin tıkayıcı hortumunu RI şişirme sistemine bağlayın (Şekil 4). Sistem, oklüderi günde 4 kez 6 dakika boyunca 10 psi'ye şişirecek ve her şişirme arasında 3 saatlik bir ara verecektir (Şekil 5).
  3. 17 günlük RI'den sonra, adım 2.1'deki gibi kardiyak fonksiyonu tekrar kontrol edin.

3. Polimer perfüzyonu ve doku hasadı

  1. Kurban etme sırasında fareyi %3-4 izofluran ile uyuşturun ve intraperitoneal olarak heparin (500 U/kg) enjekte edin. İzofluran uygulamasına en az 5 dakika boyunca% 2'de devam etmek için bir burun konisi kullanın, ardından ayak parmağı sıkışma tepkisi eksikliği ile yeterli anestezi derinliğini onaylayın.
  2. Kalbi ve torasik aortu ortaya çıkarmak için göğüs boşluğunu açın. İnen torasik aortu PE20 tüpü ile kanüle edin ve çıkışa izin vermek için inferior vena kava'yı (IVC) ikiye bölün; IVC'den çıkan sıvı berrak olana kadar kalbi 1x PBS ile retrograd olarak perfüze edin, ardından PBS'de 3 mL %1 lidokain, ardından 3 mL %4 paraformaldehit (PFA) uygulayın. Oklüderin tam konumunda LAD'ın kalıcı bir ligasyonunu yapın.
  3. Arteriyel devre dolana kadar kalbi radyoopak bir reaktif ile retrograd olarak perfüze edin. PE20 tüpünü kanama durdurucularla sıkıştırın ve polimerin 90 dakika boyunca kürlenmesine izin verin. Kalbi bir diseksiyon kapsamı altında görüntüleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Hem erkekler hem de dişiler dahil olmak üzere 136 C57BL / 6 fareden, RI ameliyatının hayatta kalma oranı% 93.4 idi ve farelerin% 80.9'u 17 günlük RI protokolünün tamamı boyunca hayatta kaldı.

Fare RI protokolü, miyokardda kalıcı yaralanma olmaksızın kısa iskemi atakları olan önceki hayvan RI modellerine(12,16) dayalı olarak optimize edilmiştir. Ameliyat sırasında, oklüderinin ş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Koroner kollateraller, IHD hastaları için doğal bir baypastır. Anjiyogenez17'yi hedef alan başarısız klinik çalışmalardan sonra, koroner kollateral gelişimin teşvik edilmesi bu hastalar için daha iyi bir terapötik yaklaşım olabilir. Sadece tek bir endotel hücresi tabakasına sahip olan anjiyogenezden türetilen kılcal damarlardan farklı olarak, teminatlar düz kas hücrelerinin kapsama alanına sahip olgun arterlerdir. Teminatlar, obstrüktif ar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, burada tartışılan yöntemlere katkılarından dolayı Weiguo Wan, Cody Juguilon, Iyanuoluwa Ogunmiluyi ve Devan Richardson'a teşekkür eder. Bu çalışma 1R15HL115540-01 ve 1 R01 HL137008-01A1 tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
#5/45 degree forcepsFine Science Tools11251-35
1/4" Closed Brass Electric Solenoid ValveU.S. SolidUSS2-00054inflation system
1/4" Open Brass Electric Solenoid ValveAceCrewinflation system
1/4" pneumatic tubing‎China SNS Pneumatic Co.,Ltd‎APU1/4-32.8ftpush-button device
1/4" push-in connectorsRuoFeng543Ypush-button device
1/8" brass fittingsEdge Industrialinflation system
2 Position Pneumatic Electric Solenoid ValveU.S. SolidUSS- PSV00033push-button device
20G angiocathBD381703
45 degree Castroviejo needle holdersRobozRS-6421
6-0 polyglactin suturesDemeTECHG176011B13M
6-0 polypropylene suturesAD SugicalXS-P618R11
70% Ethanol
8-0 polypropylene suturesDemeTECHPM19800, 65G0P
BetadinePurdue Products367618150085
Blunt nosed scissorsWorld Precision Intruments500366
Carbon fiber arrow shaftpost-surgical cage; cut to 12.5 cm
Cotton swabs (3")Puritan872-PC DBL
Curity Gauze Sponges (2x2)Cardinal Health2146
Dipsey swivel sinkersWater Gremlinpost-surgical cage
Electrode creamSignacreme17-05
GlycopyrrolateWestward0143-9679-01
Hartman hemostatsFine Science Tools13003-10
IsofluraneCovetrus29404
Ketofen (ketoprofen)zoetis10004031
Lidocaine (2%)Covetrus14583
MICROFIL (yellow)Flow TekMV-122
Mini Push ButtonInteractiviaE-SWC-PBM-PBS-105push-button device
Miniature Air Pressure RegulatorPneumaticPlusPPR2-N02BG-4push-button device
Mini-Colibri spring retractorFine Science Tools17000-01
MiniVent ventilatorHarvard Apparatus73-0044
OccluderCustom made
Octagon handled forcepsFine Science Tools11041-08
Ohan Rodent Intubation SystemBMR SupplyOhan-201
Paraformaldehyde solution 4% in PBSSanta Cruzsc-281692
PE20 tubing
PE50 tubing
Plastic swivel (1 channel)Instech375/25PSpost-surgical cage
Premixed PBS Buffer, 10xRoche11666789001Diluted to 1x
Pressure GaugePIC Gauges102D-158D-10/32push-button device
Programmable Digital Outlet TimerBN-LINK‎BND-60/SU105inflation system
Puralube Vet Opthalmic OintmentDechra17033-211-38
Retractors w/ 18200-07 elastomerFine Science Tools18200-10 and 18200-11
Rodent Surgical Monitor+Scintica900-0053-01
Round handled suture tying forcepsFine Science Tools18026-10
Snap-lock barrel swivel (size 5)Eagle Claw‎01032-005post-surgical cage
Straight needle holdersFine Science Tools12060-01
TetherInstechPS62

Referanslar

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93-e621 (2023).
  2. Chilian, W. M., et al. Coronary collateral growth--back to the future. J Mol Cell Cardiol. 52 (4), 905-911 (2012).
  3. Liu, Z., et al. Coronary collateralization shows sex and racial-ethnic differences in obstructive artery disease patients. PLoS One. 12 (10), e0183836(2017).
  4. Kinnaird, T., Stabile, E., Zbinden, S., Burnett, M. S., Epstein, S. E. Cardiovascular risk factors impair native collateral development and may impair efficacy of therapeutic interventions. Cardiovasc Res. 78 (2), 257-264 (2008).
  5. Traupe, T., Gloekler, S., de Marchi, S. F., Werner, G. S., Seiler, C. Assessment of the human coronary collateral circulation. Circulation. 122 (12), 1210-1220 (2010).
  6. Schaper, W. Collateral vessels reduce mortality. Eur Heart J. 33 (5), 564-566 (2012).
  7. Meier, P., et al. The impact of the coronary collateral circulation on mortality: a meta-analysis. Eur Heart J. 33 (5), 614-621 (2012).
  8. Hirode, G., Wong, R. J. Trends in the prevalence of metabolic syndrome in the United States, 2011-2016. JAMA. 323 (24), 2526-2528 (2020).
  9. Turhan, H., et al. Impaired coronary collateral vessel development in patients with metabolic syndrome. Coron Artery Dis. 16 (5), 281-285 (2005).
  10. Ishikawa, K., et al. Development of a preclinical model of ischemic cardiomyopathy in swine. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (2), H530-H537 (2011).
  11. Rys, R., et al. An automated coronary artery occlusion device for stimulating collateral development in vivo. J Pharmacol Toxicol Methods. 48 (2), 111-118 (2002).
  12. Toyota, E., et al. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112 (14), 2108-2113 (2005).
  13. Zhang, H., Faber, J. E. De novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2⁺ bone marrow cells. J Mol Cell Cardiol. 87, 4-16 (2015).
  14. Jamaiyar, A., et al. The essential role for endothelial cell sprouting in coronary collateral growth. J Mol Cell Cardiol. 165, 158-171 (2022).
  15. Yin, L., et al. Induction of vascular progenitor cells from endothelial cells stimulates coronary collateral growth. Circ Res. 110 (2), 241-252 (2012).
  16. Lavine, K. J., Kovacs, A., Weinheimer, C., Mann, D. L. Repetitive myocardial ischemia promotes coronary growth in the adult mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2 (5), e000343(2013).
  17. Simons, M., et al. Clinical trials in coronary angiogenesis: issues, problems, consensus: An expert panel summary. Circulation. 102 (11), E73-E86 (2000).
  18. Leavesley, S. J., Ledkins, W., Rocic, P. A device for performing automated balloon catheter inflation ischemia studies. PLoS One. 9 (4), e95823(2014).
  19. Aghajanian, A., et al. Decreased inspired oxygen stimulates de novo formation of coronary collaterals in adult heart. J Mol Cell Cardiol. 150, 1-11 (2021).
  20. He, L., et al. Genetic lineage tracing discloses arteriogenesis as the main mechanism for collateral growth in the mouse heart. Cardiovasc Res. 109 (3), 419-430 (2016).
  21. Das, S., et al. A unique collateral artery development program promotes neonatal heart regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142.e18 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 219Koroner kollateral b y metekrarlayan iskemifare modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır