Mausmodell des koronaren Kollateralwachstums durch repetitive Ischämie

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung des postnatalen koronaren Kollateralwachstums vorgestellt, das durch repetitive Ischämie bei Mäusen induziert wird, einschließlich der chirurgischen Implantation eines pneumatischen Okkluders an der linken vorderen absteigenden Arterie, eines automatisierten Aufblassystems für das repetitive Ischämieprotokoll und potenzieller Methoden zur Bewertung des Kollateralwachstums.

Zusammenfassung

Koronare Kollateralen sind ein natürlicher Bypass bei ischämischen Herzkrankheiten (IHD), und so ist das koronare Kollateralwachstum (CCG) seit vielen Jahren ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für IHD, insbesondere bei Patienten mit Typ-2-Diabetes oder metabolischem Syndrom, bei denen CCG beeinträchtigt ist. Dieser Prozess ist jedoch noch wenig untersucht, was zum Teil auf den Mangel an Mausmodellen für CCG zurückzuführen ist, obwohl andere Tiermodelle wie Schweine, Hunde und Ratten etabliert wurden. Ein Mausmodell kann die vielen genetischen Modifikationen, die für die Spezies zur Verfügung stehen, einschließlich der Abstammungsverfolgung und der Genregulation (Überexpression oder Knockout), nutzen, um den Prozess und den Mechanismus von CCG aufzuklären, einschließlich der beteiligten Signalwege und Zelltypen. Wir haben uns daher daran gemacht, ein Mausmodell von CCG zu entwickeln, das durch repetitive Ischämie (RI) über transiente, repetitiver Verschluss der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD). Dieses Manuskript enthält Details zu diesem Maus-CCG-Modell, einschließlich der RI-Operation zur Implantation eines pneumatischen Okkluders auf dem LAD, des automatisierten druckbasierten Aufblassystems, das zur Steuerung des Drucks und des Zeitpunkts des Aufblasens verwendet wird, und der Ablauf des RI-Protokolls. Diese Methode hat bereits eine Veröffentlichung hervorgebracht, die den durch RI induzierten CCG-Prozess aufklärt und zeigt, dass die sprießende Angiogenese bei erwachsenen Mausherzen zu reifen Koronararterien in CCG führt.

Einleitung

Die ischämische Herzkrankheit (IHD) ist die häufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten, und jährlich werden mehr als 200.000 Bypass-Operationen an der Koronararterien durchgeführt, um die Krankheit zu behandeln¹. Koronare Kollateralen, Anastomosen zwischen den Ästen des Koronararterienbaums, sind ein natürlicher Bypass, der das ischämische Gewebe stromabwärts einer Blockade wieder mit Blut versorgen kann²; Die Menschen weisen jedoch eine große Variation im Ausmaß ihrer nativen Sicherheitennetzwerke auf ^3,4. Patienten mit IHD, die eine umfangreichere koronare Kollateralisation aufweisen, haben bessere Ergebnisse bei kardialen Ereignissen, einschließlich einer geringeren Infarktgröße und Mortalität. Daher ist das koronare Kollateralwachstum (CCG) seit über einem Jahrzehnt ein therapeutisches Ziel ^5,6,7. Es ist von besonderem Interesse für die wachsende Zahl von Patienten mit metabolischem Syndrom⁸, die eine schlechtere koronare Kollateralisation aufweisen⁹. Solange der Prozess und der Mechanismus von CCG jedoch nicht besser verstanden sind, ist es unwahrscheinlich, dass der Versuch, CCG zur Behandlung von IHD zu induzieren, fruchtbar sein wird.

Koronare Kollateralen wurden in Großtiermodellen untersucht, und kurze, sich wiederholende Verschlüsse der Hauptkoronararterien wurden verwendet, um CCG bei Schweinen¹⁰, Hunden¹¹ und Ratten¹² zu induzieren. Ein Mausmodell von CCG hätte jedoch mehr Vorteile bei der Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen von CCG, da viele genetisch veränderte Mauslinien leicht verfügbar sind, einschließlich Lineage-Tracing, gen- oder zellspezifischer transgener und Knockout-Linien. Interessanterweise wird berichtet, dass Mäuse im Gegensatz zum Menschen keine nativen koronaren Kollateralen haben^13,14, was sie zu einem attraktiven Modell für die Untersuchung der koronaren Kollateralbildung macht. In der Tat zeigte ein kürzlich veröffentlichter Bericht, dass bei Patienten mit obstruktiver arterieller Verschlusskrankheit fast die Hälfte (47 %) keine Kollateralisation aufwies (Rentrop-Grad 0)³; somit könnte ein Mausmodell von CCG für Patienten mit minimaler nativer Kollateralisierung klinisch relevant sein.

Aus diesem Grund haben wir ein Mausmodell der CCG entwickelt, das durch repetitive Ischämie induziert wird, mit einem aufblasbaren Ballonokkluder über der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD), der ein druckbasiertes Aufblassystem verwendet, das mit einem Timer automatisiert wird. Das repetitive Ischämie-Protokoll ist in der Lage, das Kollateralwachstum zu stimulieren, wie eine kürzlich erschienene Veröffentlichung^{zeigt 14}. Dieses Mausmodell von CCG wird neue Einblicke in den Prozess von CCG auf zellulärer und molekularer Ebene liefern und kann zur Validierung potenzieller Ziele zur Förderung von CCG verwendet werden.

Protokoll

Die beschriebenen Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Northeast Ohio Medical University genehmigt.

1. Chirurgische Vorbereitung

HINWEIS: Verwenden Sie für das RI-Protokoll C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts mit einem Gewicht von mindestens 25 g. Verwenden Sie während der gesamten Operation eine aseptische Technik.

1. Einrichtung
   1. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge in einem Autoklaven oder Bead-Sterilisator. Sterilisieren Sie empfindliche Materialien und Implantate wie Okkluder, Haltegurte und PE-Schläuche mit Ethylenoxid (EtO).
   2. Reinigen Sie den Operationsbereich, indem Sie alle Bereiche mit 70% Ethanol abwischen. Bereiten Sie den Bereich vor, indem Sie alle Werkzeuge und Verbrauchsmaterialien auf sterilen Vorhängen auslegen. Eine vollständige Liste der Verbrauchsmaterialien finden Sie in der Materialtabelle .
2. Intubation von Mäusen
   1. Betäuben Sie die Maus kurz mit 3% Isofluran mit Sauerstoff (1 L/min Flussrate), bis der Aufrichtreflex verloren ist. Rasieren Sie den Brustbereich, die Mitte des Rückens und hinter dem rechten Ohr; Entfernen Sie lose Haare vollständig. Injizieren Sie Glycopyrrolat intramuskulär in einer Menge von 0,01-0,02 mg/kg.
   2. Betäuben Sie erneut mit 3%-4% Isofluran für 5 min. Lege die Maus in Rückenlage auf eine Schräge, die von ihren oberen Schneidezähnen festgehalten ist, und bewege die Zunge mit einer abgestumpften Pinzette zur Seite. Intubieren Sie die Maus schnell mit einem 20G-Angiokath unter Verwendung eines faseroptischen Lichts und eines Vergrößerungslaryngoskops.
   3. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine wärmende OP-Matte und schließen Sie den Intubationsschlauch an ein Kleintierbeatmungsgerät mit 3% Isofluran an. Bestätigen Sie die Intubation, indem Sie auf rhythmisches bilaterales Anheben des Brustkorbs prüfen. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe durch fehlendes Einklemmen der Zehen.
3. Vorbereitung des Operationsfeldes
   1. Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
   2. Reinigen Sie die rasierten Stellen mit Betadin und dann 70% Ethanol und wischen Sie sie einmal unidirektional ab.
   3. Tragen Sie Elektrodencreme auf die Kontakte des Elektrokardiogramms (EKG) auf der Operationsunterlage auf und kleben Sie die Gliedmaßen der Maus darauf. Drapieren Sie sterile Gaze über die untere Hälfte der Maus.
   4. Überwachen Sie die Atemfrequenz, die Temperatur und die Narkosetiefe während des Eingriffs über die Softwareschnittstelle der Operationsunterlage.
4. Implantation des linken Thorakotos und des Okkluders
   1. Verringern Sie Isofluran auf 2%. Machen Sie mit einer Schere einen 2-3 cm langen Mittellinienschnitt in die Haut an der Brust und trennen Sie dann mit einer gebogenen Pinzette sanft die Haut- und Muskelschichten auf der linken Seite der Brust (Abbildung 1A).
   2. Machen Sie mit einer abgestumpften Pinzette vorsichtig eine Öffnung durch die Brustwand, um das Herz freizulegen, typischerweise zwischen dem 3^. und 5^. Interkostal.
   3. Verwenden Sie einen Retraktor, um die Rippen sanft zu spreizen und das Herz sichtbar zu machen. Reißen Sie mit einer abgestumpften Pinzette das Perikard auf, um das Herz freizulegen. Lokalisieren Sie die linke Ohrmuschel (Abbildung 1B) und visualisieren Sie nach Möglichkeit den basalen Teil der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD).
   4. Pass an 8-0 Polypropylen-Naht durch das Myokard unterhalb des LAD.
      HINWEIS: Der Abstand zwischen Ein- und Ausgang sollte in etwa der Breite des Okkluders entsprechen und senkrecht zum KOP stehen.
   5. Aufroller entfernen. Schieben Sie mit einer spitzen Pinzette das Ende des Okkluderschlauchs durch die Brustwand im zweiten unteren Interkostalraum nach außen und ziehen Sie den Okkluderschlauch durch die Brustwand heraus, bis sich der Okkluder über dem Herzen in der Brusthöhle befindet.
   6. Binden Sie den Okkluder mit einem chirurgischen Knoten fest am Herzen fest (Abbildung 1C), so dass der Okkluder auf dem Herzen liegt, aber nicht in dieses drückt.
   7. Pumpen Sie den Okkluder kurz (~10 s) bei 10 psi mit der Druckknopf-Aufblasvorrichtung auf (Abbildung 2). Überprüfen Sie das EKG, um die ST-Erhöhung während des Aufblasens zu bestätigen und, wenn möglich, das Blanchieren der Herzspitze visuell zu bestätigen. Passen Sie die Position oder Spannung der Naht nach Bedarf an, um die Ischämie zu bestätigen.
5. Schließen
   1. Die flankierenden Rippen mit einer Naht aus Polypropylen 6-0 verschließen und die Thoraxdrainage einführen. Evakuieren Sie Luft und Blut aus der Brust und entfernen Sie dann die Thoraxdrainage. Tragen Sie 2% Lidocain auf den geschlossenen Schnitt in der Brustwand auf.
   2. Tunneln Sie den Okkluderschlauch mit einer spitzen Pinzette unter der Haut der rechten Schulter hindurch, um den Schlauch durch die Haut hinter dem rechten Ohr nach außen zu führen. Ersetzen Sie die Brustmuskulatur und verschließen Sie die Haut mit einer 6-0-Polyglactin-Naht (Abbildung 1D).
   3. Drehen Sie die Maus in die Bauchlage. Verabreichen Sie Ketoprofen subkutan in einer Dosierung von 3 mg/kg (unter Verwendung einer Verdünnung von 1 mg/ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung) mindestens 30 Minuten vor Ende der Operation.
6. Tether-Implantation
   1. Machen Sie mit einer kleinen Schere einen kleinen (1 cm) Schnitt in der Mitte des Rückens in die Haut und trennen Sie die Haut vorsichtig vom Unterhautfett- und Muskelgewebe.
   2. Tunneln Sie den Okkluderschlauch bis zum Schnitt in der Mitte des Rückens, verlinken Sie ihn nach außen und fädeln Sie ihn durch das Seil. Verwenden Sie eine 6-0-Naht, um das kleine Loch in der Nähe des Ohrs zu schließen.
   3. Verwenden Sie 6-0 Polypropylen-Nähte, um das Leine an den Rückenmuskeln zu befestigen (Abbildung 1E). Schließen Sie die Haut über dem Tether-Knopf mit 6-0-Nähten.
7. Genesung
   1. Entfernen Sie den Intubationsschlauch, sobald die Maus selbstständig atmen kann. Setzen Sie die Maus in einen postoperativen RI-Käfig (für ein einzelnes Tier; Abbildung 3) Sobald die Reaktion auf das Einklemmen des Fußes zurückgekehrt ist. Überwachen Sie die Maus kontinuierlich, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustbeinlage aufrecht zu erhalten. Stellen Sie den Käfig auf ein Wärmekissen, bis die Maus wieder voll beweglich ist.
   2. Verabreichen Sie am nächsten Tag eine zweite Dosis Ketoprofen subkutan in einer Dosierung von 3 mg/kg.
   3. Lassen Sie die Maus 5-7 Tage ruhen, bevor Sie mit dem RI-Protokoll beginnen. Überwachen Sie die Mäuse täglich auf die Unversehrtheit der Instrumente und wechseln Sie die Käfige nach Bedarf. Stellen Sie bei Bedarf eine geeignete Anreicherung bereit, da die Mäuse für die Dauer des RI-Protokolls in Einzelhaltung gehalten werden.

2. Wiederholte Ischämie

1. Überprüfen Sie die Platzierung des Okkluders durch Echokardiographie am Tag 0 des RI-Protokolls, wie zuvor beschrieben¹⁵. Beobachten Sie die Abnahme der Herzfunktion während des Aufblasens des Okkluders.
2. Verbinden Sie den Okkluderschlauch der Maus mit dem RI-Aufblassystem (Abbildung 4). Das System bläst den Okkluder 4x täglich 6 Minuten lang auf 10 psi auf, mit einer Pause von 3 Stunden zwischen jedem Aufblasen (Abbildung 5).
3. Nach 17 Tagen RI ist die Herzfunktion wie in Schritt 2.1 erneut zu überprüfen.

3. Polymerperfusion und Gewebeentnahme

1. Zum Zeitpunkt der Tötung betäuben Sie die Maus mit 3%-4% Isofluran und injizieren Sie Heparin (500 U/kg) intraperitoneal. Verwenden Sie einen Nasenkonus, um die Verabreichung von Isofluran bei 2% für mindestens 5 Minuten fortzusetzen, und bestätigen Sie dann die angemessene Anästhesietiefe durch fehlendes Einklemmen der Zehen.
2. Öffnen Sie die Brusthöhle, um das Herz und die thorakale Aorta freizulegen. Kanülieren Sie die absteigende thorakale Aorta mit einem PE20-Schlauch und halbieren Sie die untere Hohlvene (IVC), um einen Abfluss zu ermöglichen. perfundieren Sie das Herz retrograd mit 1x PBS, bis die Flüssigkeit, die aus der IVC austritt, klar ist, gefolgt von 3 ml 1% Lidocain und dann 3 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Machen Sie eine dauerhafte Ligatur des LAD an der genauen Position des Okkluders.
3. Perfundierten Sie das Herz retrograde mit einem röntgendichten Reagenz, bis der arterielle Kreislauf gefüllt ist. Klemmen Sie den PE20-Schlauch mit Hämostaten fest und lassen Sie das Polymer 90 Minuten lang aushärten. Stellen Sie sich das Herz unter einem Sezierbereich vor.

Ergebnisse

Von 136 C57BL/6-Mäusen, darunter sowohl männliche als auch weibliche Mäuse, betrug die Überlebensrate der RI-Operation 93,4 %, wobei 80,9 % der Mäuse das gesamte 17-tägige RI-Protokoll überlebten.

Das Maus-RI-Protokoll wurde auf der Grundlage früherer tierischer RI-Modelle^12,16 optimiert, die kurze Ischämie-Episoden ohne bleibende Schädigung des Myokards aufweisen. Während der Operation kann die funktionelle Beurteilung des Okkluders erfolgen, indem eine sichtbare Blanchierung der LV-Spitze und eine ST-Erhöhung im EKG während der Inflation des Okkluders beobachtet werden, die sich beide nach der Deflation wieder normalisieren (Abbildung 6). Nach der postoperativen Erholungsphase wurde die Funktion des Okkluders an Tag 0 sowohl vor als auch während des Aufblasens des Okkluders erneut echokardiographisch überprüft. Sowohl die Ejektionsfraktion (EF) als auch die fraktionelle Verkürzung (FS) sind während des Aufblasens verringert, was darauf hindeutet, dass der Okkluder korrekt platziert wurde und im aufgeblasenen Zustand Ischämie und verminderte Funktion verursacht (Abbildung 7A). Diese Parameter können an Tag 17 erneut beurteilt werden; Wenn sich die Herzfunktion während der Okkluderinflation über die 17 Tage verbessert hat, wie in Abbildung 7A zu sehen, deutet dies darauf hin, dass die durch die Inflation des Okkluders induzierte Ischämie durch Kollateralen gelindert wurde, die über die RI-Periode gewachsen sind und nun die kollateralabhängige Zone (CZ) wieder versorgen.

Neben dem funktionellen Assay durch Echokardiographie besteht eine weitere Beurteilung der CCG darin, das Vorhandensein von Kollateralgefäßen durch Perfusion eines röntgendichten Polymers sichtbar zu machen. Es wird berichtet, dass Mäuse keine nativen Kollateralen¹³ haben, so dass in einem nativen Mausherz (keine Operation oder RI) die Ligatur des LAD, gefolgt von einer retrograden Perfusion des Polymers, eine ungefüllte CZ-Region stromabwärts der Ligatur erzeugt, in der die Arterien nicht mit Polymer gefüllt sind, weil der Fluss gestoppt wurde (Abbildung 7B). Im Gegensatz dazu deutet das Vorhandensein von gefüllten Arterien in der CZ auf das Vorhandensein einer Kollateralzirkulation hin. Bei Mäusen, die sich dem RI-Protokoll unterzogen haben, wird das CZ nach der Ligation an der Okkluderposition über die während der RI-Periode entwickelten Kollateralen mit Polymer perfundiert (Abbildung 7C).

Abbildung 1: Chirurgische Ansicht der wichtigsten Schritte. (A) Lokalisation für die Thorakotomie, die durch Pinzettenspitzen nach dem Mittellinienschnitt und der Retraktion von Haut und Muskeln angezeigt wird. (B) Das Herz nach Thorakotomie; Das gelbe Sternchen zeigt die Position der linken Ohrmuschel an. (C) Die Platzierung des Okkluders auf dem Herzen (weißer Pfeil) und des nach außen gerichteten Schlauches durch den zweiten unteren Interkostalraum (blauer Pfeil). (D) Der Blick nach dem Schließen der Truhe; Der weiße Pfeil zeigt den subkutanen Okkluderschlauch, und der gelbe Pfeil zeigt, wo der Schlauch an der rechten Schulter nach außen getragen ist. (E) Die Fixierung des Seils am Rücken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Druckknopfvorrichtung zum Aufblasen des Okkluders. Die Aufblasvorrichtung besteht aus (A) einem Regler, (B) einem elektrischen Magnetventil, (C) einem Ein-/Aus-Druckknopf und (D) einem Manometer; Er verjüngt sich am Ende (E), um ihn mit dem Okkluderschlauch zu verbinden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Postoperativer Mauskäfig. Zu den Komponenten gehören (A) ein Kunststoff-Haltewirbel, (B) Kohlefaserrohre und (C) ein Gegengewicht aus Schnappwirbel und Platinen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Automatisiertes Aufblassystem. Es besteht aus (A) einem normal geschlossenen elektrischen Magnetventil, (B) einem Manometer, (C) einem normalerweise offenen elektrischen Magnetventil und (D) einer Schalttafel, die an eine digital programmierbare Zeitschaltuhr angeschlossen ist. Wenn der Timer das System einschaltet, schalten die Magnete und CO₂ fließt in das System, um den Okkluder aufzublasen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Zeitleiste des RI-Protokolls. Nach der RI-Operation ruhen sich die Mäuse 5-7 Tage lang aus, bevor sie mit der ersten Echokardiographie beginnen und das RI-Protokoll beginnt, das dann 17 Tage lang bis zur endgültigen Echokardiographie und Opferung fortgesetzt wird. Das RI-Protokoll besteht aus 4 täglichen Aufblasvorgängen (6 Minuten bei je 10 psi) mit einer Pause von 3 Stunden zwischen den Aufblasvorgängen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Repräsentative Elektrokardiogramme vor, während und nach dem Aufblasen des Okkluders. (A) EKG vor dem Aufblasen (der rote Pfeil zeigt den Beginn des Aufblasens an). (B) EKG während des Aufblasens mit Anzeige der ST-Erhöhung. (C) Das EKG normalisierte sich nach der Deflation wieder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Bewertung des koronaren Kollateralwachstums (CCG). (A) Bei Wildtyp-Mäusen nahmen die Ejektionsfraktion (EF) und die fraktionelle Verkürzung (FS) während der Okkluderinflation an Tag 0 ab, was auf eine korrekte Okkluderplatzierung hinweist. An Tag 17 war die Veränderung der EF% und FS% signifikant geringer als an Tag 0, was auf CCG hinweist (n=14 an Tag 0, n=9 an Tag 17, ungepaarter Mann-Whitney U-Test wurde für die statistische Signifikanzanalyse verwendet, *p < 0,05. Diese Zahl wurde von¹⁴ geändert. (B, C) Röntgendichte Polymerperfusion mit und ohne RI. Weiße Pfeile zeigen den LAD-Ligationspunkt. Der weiße gestrichelte Kreis zeigt die kollateralabhängige Zone (CZ) an; bei Nicht-RI-Herzen gibt es keine Füllung, aber bei RI-Herzen werden die Gefäße der CZ über Kollateralen gefüllt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Koronare Kollateralen sind ein natürlicher Bypass für IHD-Patienten. Nach den gescheiterten klinischen Studien, die auf die Angiogenese¹⁷ abzielten, könnte die Förderung der Entwicklung von koronaren Kollateralen ein besserer therapeutischer Ansatz für diese Patienten sein. Im Gegensatz zu Kapillaren, die aus der Angiogenese stammen und nur eine einzige Schicht Endothelzellen aufweisen, sind Kollateralen reife Arterien mit einer Abdeckung durch glatte Muskelzellen. Kollateralen versorgen die Regionen der myokardialen Ischämie, die durch obstruktive Arterien verursacht wird, wieder mit Blut. Das Verständnis der Regulation von CCG ist entscheidend für die Entwicklung neuer Ziele zur Behandlung von IHD.

Großtiermodelle, die repetitive Ischämie zur Untersuchung von CCG verwenden, haben sich als vorteilhaft erwiesen 10,11,12, insbesondere wenn sie automatisiert wurden, um die Varianz zu reduzieren und die Zeiteffizienz zu verbessern ¹⁸, können aber die Vorteile der aktuellen genetischen Technologien nicht voll ausschöpfen. Die Skalierung eines solchen CCG-Modells auf die Größe einer Maus hat seine Herausforderungen, aber die Vorteile sind zahlreich, sowohl praktisch als auch wissenschaftlich: Mäuse kosten weniger in der Unterbringung und benötigen weniger Platz, während sie einen größeren Werkzeugkasten an genetischen Modellen bieten.

Während in den letzten Jahren mehrere Mausmodelle von CCG veröffentlicht wurden 13,16,19,20,21, hat dieses Modell mehrere Auszeichnungen ¹⁴. Repetitive Ischämie (RI) induziert Kollateralwachstum ohne Verlust oder Verletzung des Myokards, verursacht durch einen Myokardinfarkt. Nach der Okkluderimplantation kann der RI-Prozess reguliert und das Programm automatisiert werden, was sowohl für die Zeiteffizienz als auch für die Reproduzierbarkeit von Vorteil ist¹⁸; Das automatisierte Aufblassystem ist kostengünstig und einfach zu programmieren und zu bedienen, ohne dass ein Computersystem erforderlich ist. Das Kollateralwachstum kann durch Messung der Herzfunktion mit und ohne Inflation des Okkluders bewertet werden, ein guter Proxy-Indikator für das Vorhandensein eines koronaren Kollateralflusses. Darüber hinaus ist die Perfusion mit einem röntgendichten Polymer zur Darstellung des Gefäßsystems des Herzens einfach und kostengünstig. Obwohl das gesamte Verfahren komplex ist und einen erfahrenen Chirurgen erfordert, ermöglicht das Mausmodell der CCG die Induktion des kollateralen Wachstums in einem erwachsenen Herzen, was einen neuen Bereich für die Untersuchung der Regulation der CCG eröffnet und ein Werkzeug zur Verfügung stellt, um die therapeutischen Ziele zur Förderung des kollateralen Wachstums bei IHD zu testen.

Während die hier vorgestellten Daten für Wildtyp-Mäuse im Alter von 4-6 Monaten gelten, könnte das Protokoll an die unterschiedlichen Bedürfnisse verschiedener Studien angepasst werden, indem Fragen zu Faktoren untersucht werden, die CCG beeinflussen, wie z. B. Genregulation, Geschlechtsunterschiede, Alterung und kardiovaskuläre Pathologien. Wir empfehlen die Verwendung von Mäusen von mindestens 25 g aufgrund der Größe des Okkluders im Verhältnis zum Mausherz. Wir sind uns auch bewusst, dass das Altern ein Risikofaktor für alle Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist und seine Auswirkungen auf CCG unbekannt sind. Wir würden erwarten, dass sich die chirurgischen Überlebensraten oder das Ergebnis des Kollateralwachstums bei gealterten Mäusen aufgrund der Länge und Komplexität der Operation oder des systemischen Alterungsphänotyps von denen des Wildtyps unterscheiden könnten.

Die chirurgische Vorbereitung auf das RI-Protokoll ist in der Tat länger und komplizierter als eine typische MI-Operation, bei der zwei Implantate und die Neupositionierung der Maus während der Operation erforderlich sind. Die Beachtung mehrerer wichtiger Schritte wird dazu beitragen, den Prozess zu erleichtern. Der kritischste Schritt des Eingriffs ist die Okkluderimplantation, bei der die LAD beim Durchlaufen der Naht durch das Myokard genau umschrieben und die richtige Spannung der Naht beim Aufbinden des Okkluders erreicht werden muss. Die genaue Positionierung des Okkluders ist einfach zu beurteilen: Eine erfolgreiche Platzierung führt sowohl zum apikalen Blanchieren als auch zu einer ST-Hebung, wenn der Okkluder aufgeblasen wird. Andernfalls erscheinen das Myokard und das EKG normal. Es ist wichtig, das EKG mit und ohne Aufblasen während der RI-Operation sowie die Herzfunktion mit und ohne Aufblasung nach der Operation am Tag 0 zu überprüfen. Wenn eine Maus einen Myokardinfarkt ohne Inflation des Okkluders hat, sollte das Tier aus der Studie entfernt werden. Bevor Okkluder implantiert werden, müssen sie auf optimalen Druck getestet werden. Die Tether-Implantation ist ein weiterer wichtiger Schritt, da der Tether den Okkluderschlauch vor Beschädigungen durch die Maus schützt, die das RI-Protokoll vorzeitig beenden würden. Eine unsachgemäße Platzierung kann zu Hautnekrosen führen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Mausmodell der CCG über repetitive Ischämie ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung des Mechanismus und der Regulation von CCG und für das Screening von Therapeutika ist, die für die Behandlung von IHD entwickelt wurden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 degree forceps	Fine Science Tools	11251-35
1/4" Closed Brass Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS2-00054	inflation system
1/4" Open Brass Electric Solenoid Valve	AceCrew		inflation system
1/4" pneumatic tubing	‎China SNS Pneumatic Co.,Ltd	‎APU1/4-32.8ft	push-button device
1/4" push-in connectors	RuoFeng	543Y	push-button device
1/8" brass fittings	Edge Industrial		inflation system
2 Position Pneumatic Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS- PSV00033	push-button device
20G angiocath	BD	381703
45 degree Castroviejo needle holders	Roboz	RS-6421
6-0 polyglactin sutures	DemeTECH	G176011B13M
6-0 polypropylene sutures	AD Sugical	XS-P618R11
70% Ethanol
8-0 polypropylene sutures	DemeTECH	PM19800, 65G0P
Betadine	Purdue Products	367618150085
Blunt nosed scissors	World Precision Intruments	500366
Carbon fiber arrow shaft			post-surgical cage; cut to 12.5 cm
Cotton swabs (3")	Puritan	872-PC DBL
Curity Gauze Sponges (2x2)	Cardinal Health	2146
Dipsey swivel sinkers	Water Gremlin		post-surgical cage
Electrode cream	Signacreme	17-05
Glycopyrrolate	Westward	0143-9679-01
Hartman hemostats	Fine Science Tools	13003-10
Isoflurane	Covetrus	29404
Ketofen (ketoprofen)	zoetis	10004031
Lidocaine (2%)	Covetrus	14583
MICROFIL (yellow)	Flow Tek	MV-122
Mini Push Button	Interactivia	E-SWC-PBM-PBS-105	push-button device
Miniature Air Pressure Regulator	PneumaticPlus	PPR2-N02BG-4	push-button device
Mini-Colibri spring retractor	Fine Science Tools	17000-01
MiniVent ventilator	Harvard Apparatus	73-0044
Occluder			Custom made
Octagon handled forceps	Fine Science Tools	11041-08
Ohan Rodent Intubation System	BMR Supply	Ohan-201
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz	sc-281692
PE20 tubing
PE50 tubing
Plastic swivel (1 channel)	Instech	375/25PS	post-surgical cage
Premixed PBS Buffer, 10x	Roche	11666789001	Diluted to 1x
Pressure Gauge	PIC Gauges	102D-158D-10/32	push-button device
Programmable Digital Outlet Timer	BN-LINK	‎BND-60/SU105	inflation system
Puralube Vet Opthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38
Retractors w/ 18200-07 elastomer	Fine Science Tools	18200-10 and 18200-11
Rodent Surgical Monitor+	Scintica	900-0053-01
Round handled suture tying forceps	Fine Science Tools	18026-10
Snap-lock barrel swivel (size 5)	Eagle Claw	‎01032-005	post-surgical cage
Straight needle holders	Fine Science Tools	12060-01
Tether	Instech	PS62