Modèle murin de croissance collatérale coronaire par ischémie répétitive

Résumé

Cet article présente une méthode pour étudier la croissance collatérale coronaire postnatale induite par l’ischémie répétitive chez la souris, y compris l’implantation chirurgicale d’un occluseur pneumatique sur l’artère descendante antérieure gauche, un système de gonflage automatisé pour le protocole d’ischémie répétitive et des méthodes potentielles pour évaluer la croissance collatérale.

Résumé

Les collatérales coronaires sont un contournement naturel dans les cardiopathies ischémiques (cardiopathies), et donc, depuis de nombreuses années, la croissance collatérale coronaire (CCG) est une cible thérapeutique prometteuse pour les cardiopathies ischémiques, en particulier chez les patients atteints de diabète de type 2 ou de syndrome métabolique dans lequel la CCG est altérée. Cependant, ce processus est sous-étudié, en partie à cause du manque de modèles murins de CCG, même si d’autres modèles animaux, tels que les porcs, les chiens et les rats, ont été établis. Un modèle murin peut tirer parti des nombreuses modifications génétiques disponibles pour l’espèce, y compris le traçage de la lignée et la régulation des gènes (surexpression ou knock-out), pour élucider le processus et le mécanisme de la CCG, y compris les voies et les types de cellules impliqués. Nous avons donc entrepris de développer un modèle murin de CCG induit par l’ischémie répétitive (IR) via transitoire, occlusion répétitive de l’artère descendante antérieure gauche (DAL). Ce manuscrit fournit des détails sur ce modèle de CCG chez la souris, y compris la chirurgie IR pour implanter un occluseur pneumatique sur le DAL, le système de gonflage automatisé basé sur la pression utilisé pour contrôler la pression et le moment du gonflage, et la séquence du protocole RI. Cette méthode a déjà donné lieu à une publication pour élucider le processus de CCG induit par l’IR, montrant que l’angiogenèse germinative donne naissance à des artères coronaires matures dans la CCG dans des cœurs de souris adultes.

Introduction

La cardiopathie ischémique (cardiopathie ischémique) est la principale cause de mortalité aux États-Unis, et plus de 200 000 pontages coronariens sont pratiqués chaque année dans le but de traiter la maladie¹. Les collatérales coronaires, anastomoses entre les branches de l’arbre artériel coronaire, sont une dérivation naturelle qui peut réapprovisionner en sang le tissu ischémique en aval d’un blocage² ; Cependant, les gens présentent une grande variation dans l’étendue de leurs réseaux collatéraux natifs ^3,4. Les patients atteints de cardiopathie ischémique qui ont une collatéralisation coronaire plus étendue ont de meilleurs résultats lors d’événements cardiaques, notamment une réduction de la taille de l’infarctus et de la mortalité. Par conséquent, la croissance collatérale coronaire (CCG) est une cible thérapeutique depuis plus d’une décennie ^5,6,7. Il est particulièrement intéressant pour le nombre croissant de patients atteints du syndrome métabolique⁸, qui présentent une collatéralisation coronaire plus faible⁹. Cependant, jusqu’à ce que le processus et le mécanisme de la CCG soient mieux compris, il est peu probable que la tentative d’induire la CCG pour le traitement de la cardiopathie ischémique soit fructueuse.

Les collatéraux coronaires ont été étudiés dans de grands modèles animaux, et des occlusions brèves et répétitives des principales artères coronaires ont été utilisées pour induire la CCG chez les porcs¹⁰, les chiens¹¹ et les rats¹². Cependant, un modèle murin de CCG présenterait plus d’avantages dans l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires de la CCG en raison des nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées facilement disponibles, y compris le traçage de lignées, les lignées transgéniques et knock-out spécifiques à des gènes ou à des cellules. Il est intéressant de noter que, contrairement aux humains, les souris n’ont pas de collatéraux coronaires natifs^13,14, ce qui en fait un modèle attrayant pour étudier la formation des collatéraux coronaires. En effet, un rapport récent a montré que chez les patients atteints de maladie artérielle obstructive, près de la moitié (47 %) n’avaient pas de collatéralisation (grade Rentrop 0)³ ; ainsi, un modèle murin de CCG pourrait être cliniquement pertinent pour les patients avec une garantie native minimale.

Nous avons donc développé un modèle murin de CCG induit par une ischémie répétitive, avec un obturateur à ballonnet gonflable au-dessus de l’artère descendante antérieure gauche (LAD) qui utilise un système de gonflage basé sur la pression automatisé avec une minuterie. Le protocole d’ischémie répétitive est capable de stimuler la croissance collatérale, comme le montre une publication récente¹⁴. Ce modèle murin de CCG fournira de nouvelles informations sur le processus de CCG aux niveaux cellulaire et moléculaire et pourra être utilisé pour valider des cibles potentielles pour promouvoir la CCG.

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Protocole

Les expériences sur les animaux décrites ont été menées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université médicale du nord-est de l’Ohio.

1. Préparation chirurgicale

REMARQUE : Pour le protocole RI, utilisez des souris C57BL/6 des deux sexes pesant au moins 25 g. Utilisez une technique aseptique tout au long de la chirurgie.

1. Coup monté
   1. Stérilisez tous les outils dans un autoclave ou un stérilisateur à billes. Stérilisez les matériaux délicats et les implants, tels que les tubes d’occlusion, d’attache et de PE, avec de l’oxyde d’éthylène (EtO).
   2. Nettoyez la zone chirurgicale en essuyant toutes les zones avec de l’éthanol à 70 %. Préparez la zone en disposant tous les outils et fournitures sur des champs stériles. Voir la table des matériaux pour une liste complète des fournitures.
2. Intubation chez la souris
   1. Anesthésier brièvement la souris avec de l’isoflurane à 3 % avec de l’oxygène (débit de 1 L/min) jusqu’à ce que le réflexe de redressement soit perdu. Rasez la poitrine, le centre du dos et derrière l’oreille droite ; Enlever complètement les cheveux morts. Injecter du glycopyrrolate par voie intramusculaire à raison de 0,01 à 0,02 mg/kg.
   2. Anesthésier à nouveau avec de l’isoflurane à 3 % à 4 % pendant 5 min. Placez la souris en décubitus dorsal sur une pente, retenue par ses incisives supérieures, et utilisez une pince émoussée pour écarter la langue. Intubez rapidement la souris avec un angiocath 20G à l’aide d’une lumière à fibre optique et d’un laryngoscope grossissant.
   3. Placez la souris en décubitus dorsal sur un coussin chirurgical chauffant et connectez le tube d’intubation à un ventilateur pour petit animal contenant 3 % d’isoflurane. Confirmez l’intubation en vérifiant l’élévation bilatérale rythmique de la poitrine. Confirmer la profondeur adéquate de l’anesthésie par l’absence de réponse par pincement des orteils.
3. Préparation du champ opératoire
   1. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement.
   2. Nettoyez les zones rasées avec de la bétadine puis de l’éthanol à 70 %, en essuyant une fois de manière unidirectionnelle.
   3. Appliquez de la crème pour électrodes sur les contacts de l’électrocardiogramme (ECG) sur le tampon chirurgical et collez les membres de la souris sur ceux-ci. Drapez de la gaze stérile sur la moitié inférieure de la souris.
   4. Surveillez la fréquence respiratoire, la température et la profondeur de l’anesthésie au cours de la chirurgie à l’aide de l’interface logicielle du tampon chirurgical.
4. Thoracotomie gauche et implantation d’un occluseur
   1. Réduire l’isoflurane à 2 %. Faites une incision médiane de 2 à 3 cm dans la peau du thorax à l’aide de ciseaux, puis à l’aide d’une pince incurvée, séparez doucement la peau et les couches musculaires du côté gauche du thorax (Figure 1A).
   2. À l’aide d’une pince émoussée, faites doucement une ouverture à travers la paroi thoracique pour exposer le cœur, généralement entre le 3^e et le 5^e intercostal.
   3. Utilisez un écarteur pour écarter doucement les côtes et visualiser le cœur. À l’aide d’une pince émoussée, déchirez le péricarde pour exposer le cœur. Localisez le pavillon gauche (Figure 1B) et visualisez la partie basale de l’artère descendante antérieure gauche (DAL), si possible.
   4. Passez un 8-0 suture en polypropylène à travers le myocarde sous le DAL.
      REMARQUE : La distance entre l’entrée et la sortie doit être à peu près égale à la largeur de l’occluseur et perpendiculaire au LAD.
   5. Retirez les enrouleurs. À l’aide d’une pince pointue, extériorisez l’extrémité du tube d’occlusion à travers la paroi thoracique dans le deuxième espace intercostal inférieur et tirez le tube d’occlusion à travers la paroi thoracique jusqu’à ce que l’occluseur soit situé au-dessus du cœur dans la cavité thoracique.
   6. Fixez solidement l’occluseur au cœur à l’aide d’un nœud de chirurgien (Figure 1C) afin que l’occluseur repose sur le cœur, mais n’y appuie pas.
   7. Gonflez brièvement l’occluseur (~10 s) à 10 psi à l’aide du dispositif de gonflage à bouton-poussoir (Figure 2). Vérifiez l’ECG pour confirmer l’élévation du segment ST pendant le gonflage et, si possible, confirmez visuellement le blanchiment de l’apex cardiaque. Ajustez la position ou la tension de la suture si nécessaire pour confirmer l’ischémie.
5. Fermeture
   1. Fermez les côtes latérales avec une suture en polypropylène 6-0, en insérant le tube thoracique. Évacuez l’air et le sang de la poitrine, puis retirez le drain thoracique. Appliquez 2 % de lidocaïne sur l’incision fermée dans la paroi thoracique.
   2. À l’aide d’une pince pointue, enfoncez le tube d’occlusion sous la peau de l’épaule droite pour extérioriser le tube à travers la peau derrière l’oreille droite. Remplacez les muscles de la poitrine et fermez la peau à l’aide d’une suture polyglactine 6-0 (figure 1D).
   3. Retournez la souris en position couchée. Administrer le kétoprofène par voie sous-cutanée à une dose de 3 mg/kg (en utilisant une dilution de 1 mg/mL dans une solution saline stérile à 0,9 %) au moins 30 minutes avant la fin de la chirurgie.
6. Implantation d’attache
   1. À l’aide de petits ciseaux, faites une petite incision (1 cm) sur la peau au centre du dos et séparez doucement la peau de la graisse sous-cutanée et du tissu musculaire.
   2. Tunnelisez le tube d’occlusion jusqu’à l’incision au centre du dos, extériorisez-le et enfilez-le dans la longe. Utilisez une suture 6-0 pour fermer le petit trou près de l’oreille.
   3. Utilisez des sutures en polypropylène 6-0 pour fixer la sangle aux muscles du dos (Figure 1E). Fermez la peau sur le bouton d’attache avec des sutures 6-0.
7. Récupération
   1. Retirez le tube d’intubation une fois que la souris peut respirer indépendamment ; placer la souris dans une cage IR post-chirurgicale (pour un seul animal ; Graphique 3) une fois que la réponse de pincement du pied est revenue. Surveillez continuellement la souris jusqu’à ce qu’elle ait repris une conscience suffisante pour maintenir la décubitus sternal. Placez la cage sur un coussin chauffant jusqu’à ce que la souris retrouve sa pleine mobilité.
   2. Le lendemain, administrer une deuxième dose de kétoprofène par voie sous-cutanée à 3 mg/kg.
   3. Laissez la souris reposer pendant 5 à 7 jours avant de commencer le protocole RI. Surveillez quotidiennement l’intégrité de l’instrumentation des souris et changez les cages au besoin. Fournir un enrichissement approprié au besoin, car les souris sont logées individuellement pendant la durée du protocole RI.

2. Ischémie répétitive

1. Vérifiez le placement de l’occluseur par échocardiographie au jour 0 du protocole RI, comme décrit précédemment¹⁵. Observez la diminution de la fonction cardiaque lors du gonflage de l’occluseur.
2. Connectez le tube d’occlusion de la souris au système de gonflage RI (Figure 4). Le système gonflera l’occluseur à 10 psi pendant 6 min, 4 fois par jour, avec une pause de 3 h entre chaque gonflage (Figure 5).
3. Après 17 jours d’IR, vérifiez à nouveau la fonction cardiaque comme à l’étape 2.1.

3. Perfusion de polymères et récolte de tissus

1. Au moment du sacrifice, anesthésier la souris avec de l’isoflurane à 3 % à 4 % et injecter de l’héparine (500 U/kg) par voie intrapéritonéale. Utilisez un cône nasal pour continuer l’administration d’isoflurane à 2 % pendant au moins 5 min, puis confirmez la profondeur adéquate de l’anesthésie par l’absence de réponse de pincement de l’orteil.
2. Ouvrez la cavité thoracique pour exposer le cœur et l’aorte thoracique. Canuler l’aorte thoracique descendante avec un tube PE20 et couper en deux la veine cave inférieure (CVI) pour permettre l’écoulement ; Perfuser le cœur rétrogradement avec 1x PBS jusqu’à ce que le liquide sortant de la VCI soit clair, suivi de 3 mL de lidocaïne à 1 %, puis de 3 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans le PBS. Faites une ligature permanente du DAL à la position exacte de l’obturateur.
3. Perfuser rétrogradement le cœur avec un réactif radio-opaque jusqu’à ce que le circuit artériel soit rempli. Clampez le tube PE20 avec des hémostats et laissez le polymère durcir pendant 90 min. Imagez le cœur sous une portée de dissection.

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Résultats

Sur 136 souris C57BL/6, y compris des mâles et des femelles, le taux de survie de la chirurgie IR était de 93,4 %, avec 80,9 % des souris qui ont survécu pendant toute la durée du protocole IR de 17 jours.

Le protocole d’IR chez la souris a été optimisé sur la base de modèles d’IR animaux précédents^12,16, qui présentent de courts épisodes d’ischémie sans lésion permanente du myocard...

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Discussion

Les collatéraux coronaires sont un pontage naturel pour les patients atteints de cardiopathie ischémique. Après l’échec des essais cliniques ciblant l’angiogenèse¹⁷, la promotion du développement collatéral coronaire pourrait être une meilleure approche thérapeutique pour ces patients. Contrairement aux capillaires dérivés de l’angiogenèse, qui n’ont qu’une seule couche de cellules endothéliales, les collatérales sont des artères matures a...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 degree forceps	Fine Science Tools	11251-35
1/4" Closed Brass Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS2-00054	inflation system
1/4" Open Brass Electric Solenoid Valve	AceCrew		inflation system
1/4" pneumatic tubing	‎China SNS Pneumatic Co.,Ltd	‎APU1/4-32.8ft	push-button device
1/4" push-in connectors	RuoFeng	543Y	push-button device
1/8" brass fittings	Edge Industrial		inflation system
2 Position Pneumatic Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS- PSV00033	push-button device
20G angiocath	BD	381703
45 degree Castroviejo needle holders	Roboz	RS-6421
6-0 polyglactin sutures	DemeTECH	G176011B13M
6-0 polypropylene sutures	AD Sugical	XS-P618R11
70% Ethanol
8-0 polypropylene sutures	DemeTECH	PM19800, 65G0P
Betadine	Purdue Products	367618150085
Blunt nosed scissors	World Precision Intruments	500366
Carbon fiber arrow shaft			post-surgical cage; cut to 12.5 cm
Cotton swabs (3")	Puritan	872-PC DBL
Curity Gauze Sponges (2x2)	Cardinal Health	2146
Dipsey swivel sinkers	Water Gremlin		post-surgical cage
Electrode cream	Signacreme	17-05
Glycopyrrolate	Westward	0143-9679-01
Hartman hemostats	Fine Science Tools	13003-10
Isoflurane	Covetrus	29404
Ketofen (ketoprofen)	zoetis	10004031
Lidocaine (2%)	Covetrus	14583
MICROFIL (yellow)	Flow Tek	MV-122
Mini Push Button	Interactivia	E-SWC-PBM-PBS-105	push-button device
Miniature Air Pressure Regulator	PneumaticPlus	PPR2-N02BG-4	push-button device
Mini-Colibri spring retractor	Fine Science Tools	17000-01
MiniVent ventilator	Harvard Apparatus	73-0044
Occluder			Custom made
Octagon handled forceps	Fine Science Tools	11041-08
Ohan Rodent Intubation System	BMR Supply	Ohan-201
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz	sc-281692
PE20 tubing
PE50 tubing
Plastic swivel (1 channel)	Instech	375/25PS	post-surgical cage
Premixed PBS Buffer, 10x	Roche	11666789001	Diluted to 1x
Pressure Gauge	PIC Gauges	102D-158D-10/32	push-button device
Programmable Digital Outlet Timer	BN-LINK	‎BND-60/SU105	inflation system
Puralube Vet Opthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38
Retractors w/ 18200-07 elastomer	Fine Science Tools	18200-10 and 18200-11
Rodent Surgical Monitor+	Scintica	900-0053-01
Round handled suture tying forceps	Fine Science Tools	18026-10
Snap-lock barrel swivel (size 5)	Eagle Claw	‎01032-005	post-surgical cage
Straight needle holders	Fine Science Tools	12060-01
Tether	Instech	PS62