Modelo murino de crecimiento colateral coronario a través de isquemia repetitiva

Resumen

Este artículo presenta un método para estudiar el crecimiento coronario colateral postnatal inducido por isquemia repetitiva en ratones, incluyendo la implantación quirúrgica de un oclusor neumático en la arteria descendente anterior izquierda, un sistema de inflado automatizado para el protocolo de isquemia repetitiva y métodos potenciales para evaluar el crecimiento colateral.

Resumen

Las colaterales coronarias son una derivación natural en las cardiopatías isquémicas (IHD), por lo que durante muchos años, el crecimiento de las colaterales coronarias (CCG) ha sido un objetivo terapéutico prometedor para la IHD, particularmente en pacientes con diabetes tipo 2 o síndrome metabólico en los que la CCG está alterada. Sin embargo, este proceso está poco estudiado, en parte debido a la falta de modelos de ratón de CCG, a pesar de que se han establecido otros modelos animales, como cerdos, perros y ratas. Un modelo de ratón puede aprovechar las numerosas modificaciones genéticas disponibles para la especie, incluido el rastreo del linaje y la regulación génica (sobreexpresión o knockout), para dilucidar el proceso y el mecanismo de la CCG, incluidas las vías y los tipos de células implicados. Por lo tanto, nos propusimos desarrollar un modelo de ratón de CCG inducida por isquemia repetitiva (IR) a través de transitorios, Oclusión repetitiva de la arteria descendente anterior (DA) izquierda. Este manuscrito proporciona detalles de este modelo de CCG de ratón, incluida la cirugía de RI para implantar un oclusor neumático en el LAD, el sistema de inflado automatizado basado en presión utilizado para controlar la presión y el tiempo de inflado, y la secuencia del protocolo RI. Este método ya ha generado una publicación para dilucidar el proceso de CCG inducido por RI, mostrando que la angiogénesis germinada da lugar a arterias coronarias maduras en CCG en corazones de ratones adultos.

Introducción

La cardiopatía isquémica (IHD, por sus siglas en inglés) es la principal causa de mortalidad en los Estados Unidos, y anualmente se realizan más de 200,000 cirugías de bypass de la arteria coronaria en un esfuerzo por tratar^{la enfermedad.} Las colaterales coronarias, anastomosis entre las ramas del árbol arterial coronario, son una derivación natural que puede reabastecer de sangre al tejido isquémico aguas abajo de una obstrucción²; Sin embargo, las personas exhiben una amplia variación en el alcance de sus redes colaterales nativas ^3,4. Los pacientes con CI que tienen una colateralización coronaria más extensa tienen mejores resultados durante los eventos cardíacos, incluida la reducción del tamaño del infarto y la mortalidad. De ahí que el crecimiento colateral coronario (GCC) sea una diana terapéutica desde hace más de una década^5,6,7. Es de particular interés para el creciente número de pacientes con síndrome metabólico⁸, que presentan una peor colateralización coronaria⁹. Sin embargo, hasta que no se comprendan mejor el proceso y el mecanismo de la CCG, es poco probable que el intento de inducir la CCG para el tratamiento de la CIC sea fructífero.

Las colaterales coronarias se han estudiado en modelos animales grandes, y se han utilizado oclusiones breves y repetitivas de las principales arterias coronarias para inducir CCG en cerdos¹⁰, perros¹¹ y ratas¹². Sin embargo, un modelo de ratón de CCG tendría más ventajas en el estudio de los mecanismos moleculares y celulares de CCG debido a las muchas líneas de ratones modificados genéticamente disponibles, incluido el rastreo de linajes, transgénicos específicos de genes o células y líneas knockout. Curiosamente, a diferencia de los humanos, se ha reportado que los ratones no tienen colaterales coronarias nativas^13,14, lo que los convierte en un modelo atractivo para estudiar la formación de colaterales coronarios. De hecho, un informe reciente mostró que en pacientes con enfermedad arterial obstructiva, casi la mitad (47%) no tenía colateralización (grado Rentrop 0)³; por lo tanto, un modelo de ratón de CCG podría ser clínicamente relevante para pacientes con una colateralización nativa mínima.

Por lo tanto, desarrollamos un modelo de ratón de CCG inducida por isquemia repetitiva, con un oclusor de balón inflable sobre la arteria descendente anterior (LAD) izquierda que utiliza un sistema de inflado basado en presión automatizado con un temporizador. El protocolo de isquemia repetitiva es capaz de estimular el crecimiento colateral, como se muestra en una publicación reciente¹⁴. Este modelo de ratón de CCG proporcionará nuevos conocimientos sobre el proceso de CCG a nivel celular y molecular y se puede utilizar para validar posibles objetivos para promover el CCG.

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Protocolo

Los experimentos con animales descritos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica del Noreste de Ohio.

1. Preparación quirúrgica

NOTA: Para el protocolo RI, utilice ratones C57BL/6 de ambos sexos que pesen al menos 25 g. Utilizar técnica aséptica durante toda la cirugía.

1. Arreglo
   1. Esterilice todas las herramientas en un autoclave o esterilizador de perlas. Esterilice materiales e implantes delicados, como oclusor, correa y tubos de PE, con óxido de etileno (EtO).
   2. Limpie el área quirúrgica limpiando todas las áreas con etanol al 70%. Prepare el área colocando todas las herramientas y suministros en cortinas estériles. Consulte la Tabla de Materiales para obtener una lista completa de suministros.
2. Intubación con ratón
   1. Anestesiar brevemente al ratón con isoflurano al 3% con oxígeno (caudal de 1 L/min) hasta perder el reflejo de enderezamiento. Afeita el área del pecho, el centro de la espalda y detrás de la oreja derecha; Elimina por completo el cabello suelto. Inyectar glicopirrolato por vía intramuscular a 0,01-0,02 mg/kg.
   2. Anestesiar de nuevo con isoflurano al 3%-4% durante 5 min. Coloque al ratón en posición supina en una inclinación, sujeto de sus incisivos superiores, y use pinzas desafiladas para mover la lengua a un lado. Intuble rápidamente el ratón con un angiocatio de 20G utilizando una luz de fibra óptica y un laringoscopio de aumento.
   3. Coloque el ratón en decúbito supino sobre una almohadilla quirúrgica de calentamiento y conecte el tubo de intubación a un ventilador para animales pequeños con isoflurano al 3%. Confirme la intubación comprobando si hay una elevación rítmica bilateral del tórax. Confirmar la profundidad adecuada de la anestesia por la falta de respuesta al pinzamiento de los dedos del pie.
3. Preparación del campo quirúrgico
   1. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar que se sequen.
   2. Limpie las áreas afeitadas con betadine y luego con etanol al 70%, limpiando una vez de manera unidireccional.
   3. Aplique crema de electrodos a los contactos del electrocardiograma (ECG) en la almohadilla quirúrgica y pegue las extremidades del ratón a ellos. Coloca una gasa estéril sobre la mitad inferior del ratón.
   4. Controle la frecuencia respiratoria, la temperatura y la profundidad de la anestesia durante el transcurso de la cirugía mediante la interfaz de software de la almohadilla quirúrgica.
4. Toracotomía izquierda e implante de oclusor
   1. Disminuya el isoflurano al 2%. Haga una incisión de 2-3 cm en la línea media de la piel del pecho con unas tijeras, luego use pinzas curvas para separar suavemente la piel y las capas musculares en el lado izquierdo del pecho (Figura 1A).
   2. Con pinzas desafiladas, haga suavemente una abertura a través de la pared torácica para exponer el corazón, generalmente entre el^3º y el^5º intercostal.
   3. Use un retractor para separar suavemente las costillas y visualizar el corazón. Con unas pinzas desafiladas, desgarre el pericardio para exponer el corazón. Localice la aurícula izquierda (Figura 1B) y visualice la parte basal de la arteria descendente anterior (DA) izquierda, si es posible.
   4. Pasa un 8-0 sutura de polipropileno a través del miocardio por debajo de la DA.
      NOTA: La distancia entre la entrada y la salida debe ser aproximadamente igual al ancho del oclusor y perpendicular al LAD.
   5. Retire los retractores. Con pinzas puntiagudas, exteriorice el extremo del tubo del oclusor a través de la pared torácica en el segundo espacio intercostal inferior y tire del tubo del oclusor a través de la pared torácica hasta que el oclusor se ubique sobre el corazón en la cavidad torácica.
   6. Ate el oclusor de forma segura al corazón con un nudo de cirujano (Figura 1C) de modo que el oclusor quede sobre el corazón pero no presione en él.
   7. Infle brevemente el oclusor (~10 s) a 10 psi usando el dispositivo de inflado de botón (Figura 2). Revise el electrocardiograma para confirmar la elevación del ST durante el inflado y, si es posible, confirme visualmente el blanqueamiento del ápice cardíaco. Ajuste la posición o tensión de la sutura según sea necesario para confirmar la isquemia.
5. Cierre
   1. Cierre las costillas laterales con sutura de polipropileno 6-0, insertando el tubo torácico. Evacue el aire y la sangre del tórax, luego retire el tubo torácico. Aplique lidocaína al 2% en la incisión cerrada en la pared torácica.
   2. Con pinzas puntiagudas, tunelice el tubo oclusor debajo de la piel del hombro derecho para exteriorizar el tubo a través de la piel detrás de la oreja derecha. Reemplace los músculos del pecho y cierre la piel con una sutura de poliglactina 6-0 (Figura 1D).
   3. Voltee el ratón a la posición prona. Administrar ketoprofeno por vía subcutánea a una dosis de 3 mg/kg (utilizando una dilución de 1 mg/ml en solución salina estéril al 0,9%) al menos 30 minutos antes del final de la cirugía.
6. Implantación de correas
   1. Con unas tijeras pequeñas, haga una pequeña incisión (1 cm) en la piel en el centro de la espalda y separe suavemente la piel de la grasa subcutánea y el tejido muscular.
   2. Tunelice el tubo del oclusor hasta la incisión en el centro de la espalda, exteriorícelo y páselo a través de la correa. Use una sutura 6-0 para cerrar el pequeño orificio cerca de la oreja.
   3. Use suturas de polipropileno 6-0 para fijar la correa a los músculos de la espalda (Figura 1E). Cierre la piel sobre el botón de sujeción con suturas 6-0.
7. Recuperación
   1. Retire el tubo de intubación una vez que el ratón pueda respirar de forma independiente; colocar al ratón en una jaula RI postquirúrgica (para un solo animal; Figura 3) una vez que haya regresado la respuesta de pellizco del pie. Monitoree al ratón continuamente hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Coloque la jaula sobre una almohadilla térmica hasta que el mouse recupere la movilidad completa.
   2. Al día siguiente, administrar una segunda dosis de ketoprofeno por vía subcutánea a 3 mg/kg.
   3. Deje que el mouse descanse durante 5-7 días antes de comenzar el protocolo RI. Monitoree diariamente a los ratones para verificar la integridad de la instrumentación y cambie las jaulas según sea necesario. Proporcione el enriquecimiento adecuado según sea necesario, ya que los ratones tienen una sola vivienda durante la duración del protocolo de RI.

2. Isquemia repetitiva

1. Verificar la colocación del oclusor por ecocardiografía en el día 0 del protocolo de IR, como se describió anteriormente¹⁵. Observe la disminución de la función cardíaca durante el inflado del oclusor.
2. Conecte el tubo del oclusor del ratón al sistema de inflado RI (Figura 4). El sistema inflará el oclusor a 10 psi durante 6 minutos, 4 veces al día, con un descanso de 3 horas entre cada inflado (Figura 5).
3. Después de 17 días de IR, vuelva a controlar la función cardíaca como en el paso 2.1.

3. Perfusión de polímeros y recolección de tejidos

1. En el momento del sacrificio, anestesiar al ratón con isoflurano al 3%-4% e inyectar heparina (500 U/kg) por vía intraperitoneal. Utilice un cono nasal para continuar la administración de isoflurano al 2% durante al menos 5 minutos, luego confirme la profundidad adecuada de la anestesia por falta de respuesta de pinzamiento del dedo del pie.
2. Abrir la cavidad torácica para exponer el corazón y la aorta torácica. Cánula de la aorta torácica descendente con tubo de PE20 y bisectar la vena cava inferior (VCI) para permitir la salida; perfundir el corazón retrógradamente con 1x PBS hasta que el líquido que sale de la VCI sea transparente, seguido de 3 mL de lidocaína al 1%, luego 3 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS. Realizar una ligadura permanente de la DA en la posición exacta del oclusor.
3. Perfundir retrógradamente el corazón con un reactivo radiopaco hasta que se llene el circuito arterial. Sujete el tubo de PE20 con hemostáticos y deje que el polímero se cure durante 90 minutos. Toma una imagen del corazón bajo un endoscopio de disección.

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Resultados

De 136 ratones C57BL/6, incluyendo machos y hembras, la tasa de supervivencia de la cirugía de RI fue del 93,4%, con un 80,9% de los ratones que sobrevivieron durante todo el protocolo de RI de 17 días.

El protocolo de IR en ratones fue optimizado con base en modelos animales previos de IR^12,16, que presentan episodios cortos de isquemia sin lesión permanente del miocardio. Durante la cirugía, la e...

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Discusión

Las colaterales coronarias son una derivación natural para los pacientes con IHD. Después de los ensayos clínicos fallidos dirigidos a la angiogénesis¹⁷, promover el desarrollo de colaterales coronarias podría ser un mejor enfoque terapéutico para estos pacientes. A diferencia de los capilares derivados de la angiogénesis, que tienen una sola capa de células endoteliales, las colaterales son arterias maduras con la cobertura de células musculares lisas. L...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 degree forceps	Fine Science Tools	11251-35
1/4" Closed Brass Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS2-00054	inflation system
1/4" Open Brass Electric Solenoid Valve	AceCrew		inflation system
1/4" pneumatic tubing	‎China SNS Pneumatic Co.,Ltd	‎APU1/4-32.8ft	push-button device
1/4" push-in connectors	RuoFeng	543Y	push-button device
1/8" brass fittings	Edge Industrial		inflation system
2 Position Pneumatic Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS- PSV00033	push-button device
20G angiocath	BD	381703
45 degree Castroviejo needle holders	Roboz	RS-6421
6-0 polyglactin sutures	DemeTECH	G176011B13M
6-0 polypropylene sutures	AD Sugical	XS-P618R11
70% Ethanol
8-0 polypropylene sutures	DemeTECH	PM19800, 65G0P
Betadine	Purdue Products	367618150085
Blunt nosed scissors	World Precision Intruments	500366
Carbon fiber arrow shaft			post-surgical cage; cut to 12.5 cm
Cotton swabs (3")	Puritan	872-PC DBL
Curity Gauze Sponges (2x2)	Cardinal Health	2146
Dipsey swivel sinkers	Water Gremlin		post-surgical cage
Electrode cream	Signacreme	17-05
Glycopyrrolate	Westward	0143-9679-01
Hartman hemostats	Fine Science Tools	13003-10
Isoflurane	Covetrus	29404
Ketofen (ketoprofen)	zoetis	10004031
Lidocaine (2%)	Covetrus	14583
MICROFIL (yellow)	Flow Tek	MV-122
Mini Push Button	Interactivia	E-SWC-PBM-PBS-105	push-button device
Miniature Air Pressure Regulator	PneumaticPlus	PPR2-N02BG-4	push-button device
Mini-Colibri spring retractor	Fine Science Tools	17000-01
MiniVent ventilator	Harvard Apparatus	73-0044
Occluder			Custom made
Octagon handled forceps	Fine Science Tools	11041-08
Ohan Rodent Intubation System	BMR Supply	Ohan-201
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz	sc-281692
PE20 tubing
PE50 tubing
Plastic swivel (1 channel)	Instech	375/25PS	post-surgical cage
Premixed PBS Buffer, 10x	Roche	11666789001	Diluted to 1x
Pressure Gauge	PIC Gauges	102D-158D-10/32	push-button device
Programmable Digital Outlet Timer	BN-LINK	‎BND-60/SU105	inflation system
Puralube Vet Opthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38
Retractors w/ 18200-07 elastomer	Fine Science Tools	18200-10 and 18200-11
Rodent Surgical Monitor+	Scintica	900-0053-01
Round handled suture tying forceps	Fine Science Tools	18026-10
Snap-lock barrel swivel (size 5)	Eagle Claw	‎01032-005	post-surgical cage
Straight needle holders	Fine Science Tools	12060-01
Tether	Instech	PS62