Modello murino di crescita collaterale coronarica attraverso ischemia ripetitiva

Riepilogo

Questo articolo presenta un metodo per studiare la crescita collaterale coronarica postnatale indotta da ischemia ripetitiva nei topi, incluso l'impianto chirurgico di un occlusore pneumatico sull'arteria discendente anteriore sinistra, un sistema di gonfiaggio automatizzato per il protocollo di ischemia ripetitiva e potenziali metodi per valutare la crescita collaterale.

Abstract

I collaterali coronarici sono un bypass naturale nelle cardiopatie ischemiche (IHD) e quindi per molti anni la crescita collaterale coronarica (CCG) è stata un promettente bersaglio terapeutico per l'IHD, in particolare nei pazienti con diabete di tipo 2 o sindrome metabolica in cui la CCG è compromessa. Tuttavia, questo processo è poco studiato, in parte a causa della mancanza di modelli murini di CCG, anche se sono stati stabiliti altri modelli animali, come maiali, cani e ratti. Un modello murino può sfruttare le numerose modificazioni genetiche disponibili per la specie, tra cui il tracciamento del lignaggio e la regolazione genica (sovraespressione o knockout), per chiarire il processo e il meccanismo della CCG, compresi i percorsi e i tipi di cellule coinvolte. Pertanto, abbiamo deciso di sviluppare un modello murino di CCG indotta da ischemia ripetitiva (RI) tramite transitorietà, occlusione ripetitiva dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD). Questo manoscritto fornisce dettagli su questo modello murino di CCG, tra cui l'intervento chirurgico RI per impiantare un occlusore pneumatico sul LAD, il sistema di gonfiaggio automatizzato basato sulla pressione utilizzato per controllare la pressione e i tempi di gonfiaggio e la sequenza del protocollo RI. Questo metodo ha già generato una pubblicazione per chiarire il processo di CCG indotto da RI, dimostrando che l'angiogenesi germinativa dà origine a arterie coronarie mature in CCG in cuori di topi adulti.

Introduzione

La cardiopatia ischemica (IHD) è la principale causa di mortalità negli Stati Uniti e ogni anno vengono eseguiti più di 200.000 interventi chirurgici di bypass coronarico nel tentativo di trattare^{la malattia1}. I collaterali coronarici, anastomosi tra i rami dell'albero coronarico, sono un bypass naturale in grado di rifornire di sangue il tessuto ischemico a valle di un blocco²; Tuttavia, le persone mostrano un'ampia variazione nell'estensione delle loro reti di garanzie native ^3,4. I pazienti con IHD che hanno una collateralizzazione coronarica più estesa hanno esiti migliori durante gli eventi cardiaci, tra cui riduzione delle dimensioni dell'infarto e della mortalità. Pertanto, la crescita collaterale coronarica (CCG) è stata un bersaglio terapeutico per oltre un decennio ^5,6,7. È di particolare interesse per il crescente numero di pazienti con sindrome metabolica⁸, che mostrano una collateralizzazione coronarica più scarsa⁹. Tuttavia, fino a quando il processo e il meccanismo della CCG non saranno meglio compresi, è improbabile che il tentativo di indurre la CCG per il trattamento dell'IHD sia fruttuoso.

I collaterali coronarici sono stati studiati in modelli animali di grandi dimensioni e brevi occlusioni ripetitive delle arterie coronarie principali sono state utilizzate per indurre CCG nei suini¹⁰, nei cani¹¹ e nei ratti¹². Un modello murino di CCG, tuttavia, avrebbe maggiori vantaggi nello studio dei meccanismi molecolari e cellulari del CCG a causa delle molte linee di topi geneticamente modificati prontamente disponibili, tra cui il tracciamento del lignaggio, le linee transgeniche e knockout gene-specifiche o cellule-specifiche. È interessante notare che, a differenza degli esseri umani, i topi non hanno collaterali coronarici nativi^13,14, il che li rende un modello attraente per studiare la formazione del collaterale coronarico. Infatti, un recente rapporto ha mostrato che nei pazienti con arteriopatia ostruttiva, quasi la metà (47%) non aveva collateralizzazione (Rentrop grado 0)³; pertanto, un modello murino di CCG potrebbe essere clinicamente rilevante per i pazienti con una minima collateralizzazione nativa.

Pertanto, abbiamo sviluppato un modello murino di CCG indotta da ischemia ripetitiva, con un occlusore a palloncino gonfiabile sopra l'arteria discendente anteriore sinistra (LAD) che utilizza un sistema di gonfiaggio basato sulla pressione automatizzato con un timer. Il protocollo dell'ischemia ripetitiva è in grado di stimolare la crescita collaterale, come dimostrato in una recente pubblicazione¹⁴. Questo modello murino di CCG fornirà nuove informazioni sul processo di CCG a livello cellulare e molecolare e può essere utilizzato per convalidare potenziali bersagli per promuovere CCG.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali descritti sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Northeast Ohio Medical University.

1. Preparazione chirurgica

NOTA: Per il protocollo RI, utilizzare topi C57BL/6 di entrambi i sessi del peso di almeno 25 g. Utilizzare una tecnica asettica durante l'intervento.

1. Apparecchio
   1. Sterilizzare tutti gli strumenti in un'autoclave o in uno sterilizzatore a microsfere. Sterilizzare materiali e impianti delicati, come occlusore, cavo e tubi in PE, con ossido di etilene (EtO).
   2. Pulire l'area chirurgica strofinando tutte le aree con etanolo al 70%. Preparare l'area disponendo tutti gli strumenti e le forniture su teli sterili. Vedere la Tabella dei materiali per un elenco completo delle forniture.
2. Intubazione del topo
   1. Anestetizzare brevemente il topo con isoflurano al 3% con ossigeno (portata di 1 L/min) fino a perdere il riflesso di raddrizzamento. Radere la zona del torace, il centro della schiena e dietro l'orecchio destro; Rimuovere completamente i peli sciolti. Iniettare glicopirrolato per via intramuscolare a 0,01-0,02 mg/kg.
   2. Anestetizzare nuovamente con isoflurano al 3%-4% per 5 minuti. Posiziona il topo supino su un'inclinazione, trattenuto dai suoi incisivi superiori, e usa una pinza smussata per spostare la lingua da parte. Intuba rapidamente il mouse con un angiocath da 20G utilizzando una luce a fibre ottiche e un laringoscopio d'ingrandimento.
   3. Posizionare il topo supino su un cuscinetto chirurgico riscaldante e collegare il tubo di intubazione a un ventilatore per piccoli animali con isoflurano al 3%. Confermare l'intubazione controllando la risalita ritmica bilaterale del torace. Confermare un'adeguata profondità dell'anestesia in base alla mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
3. Preparazione del campo chirurgico
   1. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza.
   2. Pulire le aree rasate con betadina e poi etanolo al 70%, strofinando una volta in modo unidirezionale.
   3. Applicare la crema per elettrodi sui contatti dell'elettrocardiogramma (ECG) sul cuscinetto chirurgico e fissare con nastro adesivo gli arti del mouse. Stendere una garza sterile sulla metà inferiore del topo.
   4. Monitora la frequenza respiratoria, la temperatura e la profondità dell'anestesia nel corso dell'intervento chirurgico utilizzando l'interfaccia software del cuscinetto chirurgico.
4. Toracotomia sinistra e impianto di occlusione
   1. Ridurre l'isoflurano al 2%. Praticare un'incisione della linea mediana di 2-3 cm nella pelle del torace usando le forbici, quindi utilizzare una pinza curva per separare delicatamente la pelle e gli strati muscolari sul lato sinistro del torace (Figura 1A).
   2. Usando una pinza smussata, praticare delicatamente un'apertura attraverso la parete toracica per esporre il cuore, in genere tra il 3^{° e il} 5^{° intercostale} .
   3. Usa un divaricatore per allargare delicatamente le costole e visualizzare il cuore. Usando una pinza smussata, strappa il pericardio per esporre il cuore. Localizzare il padiglione auricolare sinistro (Figura 1B) e visualizzare la parte basale dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD), se possibile.
   4. Passa un 8-0 sutura in polipropilene attraverso il miocardio sotto il LAD.
      NOTA: La distanza tra l'ingresso e l'uscita deve essere circa uguale alla larghezza dell'occlusore e perpendicolare al LAD.
   5. Rimuovere i divaricatori. Utilizzando una pinza appuntita, esteriorizzare l'estremità del tubo occlusore attraverso la parete toracica nel secondo spazio intercostale inferiore ed estrarre il tubo occlusore attraverso la parete toracica fino a quando l'occlusore non si trova sopra il cuore nella cavità toracica.
   6. Legare saldamente l'occlusore al cuore usando un nodo da chirurgo (Figura 1C) in modo che l'occlusore poggi sul cuore ma non prema su di esso.
   7. Gonfiare brevemente l'occlusore (~10 s) a 10 psi utilizzando il dispositivo di gonfiaggio a pulsante (Figura 2). Controllare l'ECG per confermare l'elevazione del tratto ST durante il gonfiaggio e, se possibile, confermare visivamente lo sbiancamento dell'apice cardiaco. Regolare la posizione o la tensione della sutura secondo necessità per confermare l'ischemia.
5. Chiusura
   1. Chiudere le costole laterali con sutura in polipropilene 6-0, inserendo il tubo toracico. Evacuare l'aria e il sangue dal torace, quindi rimuovere il tubo toracico. Applicare il 2% di lidocaina sull'incisione chiusa nella parete toracica.
   2. Usando una pinza appuntita, scavare un tunnel nel tubo occlusore sotto la pelle della spalla destra per esternalizzare il tubo attraverso la pelle dietro l'orecchio destro. Sostituire i muscoli del torace e chiudere la pelle con una sutura in poliglactina 6-0 (Figura 1D).
   3. Capovolgere il mouse in posizione prona. Somministrare ketoprofene per via sottocutanea alla dose di 3 mg/kg (utilizzando una diluizione di 1 mg/mL in soluzione fisiologica sterile allo 0,9%) almeno 30 minuti prima della fine dell'intervento.
6. Impianto di legatura
   1. Usando piccole forbici, praticare una piccola incisione (1 cm) sulla pelle al centro della schiena e separare delicatamente la pelle dal grasso sottocutaneo e dal tessuto muscolare.
   2. Scavare il tubo dell'occlusore fino all'incisione al centro della parte posteriore, esteriorizzarlo e infilarlo attraverso il laccio. Usa una sutura 6-0 per chiudere il piccolo foro vicino all'orecchio.
   3. Utilizzare suture in polipropilene 6-0 per fissare il laccio ai muscoli della schiena (Figura 1E). Chiudere la pelle sopra il bottone di laccio con punti di sutura 6-0.
7. Guarigione
   1. Rimuovere il tubo di intubazione una volta che il topo può respirare in modo indipendente; posizionare il topo in una gabbia RI post-chirurgica (per un singolo animale; Figura 3) Una volta che la risposta al pizzicamento del piede è tornata. Monitorare continuamente il topo fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Posiziona la gabbia su un termoforo fino a quando il mouse non riacquista la piena mobilità.
   2. Il giorno successivo, somministrare una seconda dose di ketoprofene per via sottocutanea alla dose di 3 mg/kg.
   3. Lasciare riposare il mouse per 5-7 giorni prima di iniziare il protocollo RI. Monitorare quotidianamente i topi per verificare l'integrità della strumentazione e cambiare le gabbie secondo necessità. Fornire un arricchimento appropriato secondo necessità, poiché i topi sono alloggiati singolarmente per la durata del protocollo RI.

2. Ischemia ripetitiva

1. Controllare il posizionamento dell'occlusore mediante ecocardiografia il giorno 0 del protocollo RI, come precedentemente descritto¹⁵. Osservare la diminuzione della funzione cardiaca durante il gonfiaggio dell'occlusore.
2. Collegare il tubo occlusore del mouse al sistema di gonfiaggio RI (Figura 4). Il sistema gonfierà l'occlusore a 10 psi per 6 minuti, 4 volte al giorno, con una pausa di 3 ore tra ogni gonfiaggio (Figura 5).
3. Dopo 17 giorni di IR, ricontrollare la funzione cardiaca come al punto 2.1.

3. Perfusione polimerica e raccolta tissutale

1. Al momento del sacrificio, anestetizzare il topo con isoflurano al 3%-4% e iniettare eparina (500 U/kg) per via intraperitoneale. Utilizzare un cono nasale per continuare la somministrazione di isoflurano al 2% per almeno 5 minuti, quindi confermare l'adeguata profondità dell'anestesia in caso di mancanza di risposta al pizzicamento delle dita.
2. Aprire la cavità toracica per esporre il cuore e l'aorta toracica. Incannulare l'aorta toracica discendente con un tubo PE20 e dividere in due la vena cava inferiore (IVC) per consentire il deflusso; perfondere il cuore per via retrograda con 1x PBS fino a quando il liquido che esce dall'IVC è limpido, seguito da 3 mL di lidocaina all'1%, quindi 3 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS. Effettuare una legatura permanente del LAD nella posizione esatta dell'occlusore.
3. Perfondere retrogradamente il cuore con un reagente radiopaco fino a riempire il circuito arterioso. Bloccare il tubo PE20 con gli emostatici e lasciare indurire il polimero per 90 minuti. Immagina il cuore sotto un cannocchiale di dissezione.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Su 136 topi C57BL/6, inclusi maschi e femmine, il tasso di sopravvivenza dell'intervento RI è stato del 93,4%, con l'80,9% dei topi sopravvissuti durante l'intero protocollo RI di 17 giorni.

Il protocollo RI del topo è stato ottimizzato sulla base di precedenti modelli di RI animale^12,16, che presentano brevi episodi di ischemia senza lesioni permanenti al miocardio. Durante l'intervento chirurgico, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

I collaterali coronarici sono un bypass naturale per i pazienti con IHD. Dopo il fallimento degli studi clinici sull'angiogenesi¹⁷, promuovere lo sviluppo collaterale coronarico potrebbe essere un approccio terapeutico migliore per questi pazienti. A differenza dei capillari derivati dall'angiogenesi, che hanno un solo strato di cellule endoteliali, i collaterali sono arterie mature con la copertura di cellule muscolari lisce. I collaterali riforniscono il flusso ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 degree forceps	Fine Science Tools	11251-35
1/4" Closed Brass Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS2-00054	inflation system
1/4" Open Brass Electric Solenoid Valve	AceCrew		inflation system
1/4" pneumatic tubing	‎China SNS Pneumatic Co.,Ltd	‎APU1/4-32.8ft	push-button device
1/4" push-in connectors	RuoFeng	543Y	push-button device
1/8" brass fittings	Edge Industrial		inflation system
2 Position Pneumatic Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS- PSV00033	push-button device
20G angiocath	BD	381703
45 degree Castroviejo needle holders	Roboz	RS-6421
6-0 polyglactin sutures	DemeTECH	G176011B13M
6-0 polypropylene sutures	AD Sugical	XS-P618R11
70% Ethanol
8-0 polypropylene sutures	DemeTECH	PM19800, 65G0P
Betadine	Purdue Products	367618150085
Blunt nosed scissors	World Precision Intruments	500366
Carbon fiber arrow shaft			post-surgical cage; cut to 12.5 cm
Cotton swabs (3")	Puritan	872-PC DBL
Curity Gauze Sponges (2x2)	Cardinal Health	2146
Dipsey swivel sinkers	Water Gremlin		post-surgical cage
Electrode cream	Signacreme	17-05
Glycopyrrolate	Westward	0143-9679-01
Hartman hemostats	Fine Science Tools	13003-10
Isoflurane	Covetrus	29404
Ketofen (ketoprofen)	zoetis	10004031
Lidocaine (2%)	Covetrus	14583
MICROFIL (yellow)	Flow Tek	MV-122
Mini Push Button	Interactivia	E-SWC-PBM-PBS-105	push-button device
Miniature Air Pressure Regulator	PneumaticPlus	PPR2-N02BG-4	push-button device
Mini-Colibri spring retractor	Fine Science Tools	17000-01
MiniVent ventilator	Harvard Apparatus	73-0044
Occluder			Custom made
Octagon handled forceps	Fine Science Tools	11041-08
Ohan Rodent Intubation System	BMR Supply	Ohan-201
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz	sc-281692
PE20 tubing
PE50 tubing
Plastic swivel (1 channel)	Instech	375/25PS	post-surgical cage
Premixed PBS Buffer, 10x	Roche	11666789001	Diluted to 1x
Pressure Gauge	PIC Gauges	102D-158D-10/32	push-button device
Programmable Digital Outlet Timer	BN-LINK	‎BND-60/SU105	inflation system
Puralube Vet Opthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38
Retractors w/ 18200-07 elastomer	Fine Science Tools	18200-10 and 18200-11
Rodent Surgical Monitor+	Scintica	900-0053-01
Round handled suture tying forceps	Fine Science Tools	18026-10
Snap-lock barrel swivel (size 5)	Eagle Claw	‎01032-005	post-surgical cage
Straight needle holders	Fine Science Tools	12060-01
Tether	Instech	PS62