反復性虚血による冠状動脈側副成長のマウスモデル

要約

この論文では、マウスの反復性虚血によって誘発される出生後の冠状動脈側副成長を研究する方法を紹介します。これには、左前下行動脈への空気圧閉塞器の外科的移植、反復性虚血プロトコルの自動拡張システム、および側副成長を評価するための潜在的な方法が含まれます。

要約

冠状動脈側副血行路は虚血性心疾患(IHD)の自然なバイパスであるため、長年にわたり、冠状動脈側副成長(CCG)は、特にCCGが損なわれている2型糖尿病またはメタボリックシンドロームの患者において、IHDの有望な治療標的でした。しかし、このプロセスは、ブタ、イヌ、ラットなどの他の動物モデルが確立されているにもかかわらず、CCGのマウスモデルが不足していることもあって、十分に研究されていません。マウスモデルは、系統追跡や遺伝子調節(過剰発現またはノックアウト)など、種で利用可能な多くの遺伝的修飾を利用して、関与する経路や細胞タイプを含むCCGのプロセスとメカニズムを解明できます。したがって、私たちは、一過性を介して反復性虚血(RI)によって誘発されるCCGのマウスモデルの開発に着手しました。 左前下行動脈(LAD)の反復閉塞。この原稿では、LADに空気圧オクルーダーを埋め込むRI手術、圧力とインフレーションのタイミングを制御するために使用される自動圧力ベースのインフレーションシステム、RIプロトコルのシーケンスなど、このマウスCCGモデルの詳細を提供します。この方法は、RIによって誘発されるCCGのプロセスを解明するための1つの出版物をすでに作成しており、発芽血管新生が成体マウスの心臓のCCGに成熟した冠状動脈を生じさせることを示しています。

概要

虚血性心疾患(IHD)は、米国における主要な死亡原因であり、この病気を治療するために年間200,000件以上の冠動脈バイパス手術が行われています¹。冠状動脈側副血行路、冠状動脈樹の枝の間の吻合は、閉塞²の下流の虚血組織に血液を再供給できる自然なバイパスです。しかし、人々は、ネイティブの^{担保ネットワーク3,4}の範囲に幅広いばらつきを示します。IHDの患者さんで、冠動脈の側副治療が広範囲に及んでいるほど、心筋梗塞の縮小や死亡率の低下など、心イベント時の転帰が良好です。したがって、冠状動脈側副成長(CCG)は10年以上にわたって治療標的となっています^5,6,7。これは、冠状動脈の側副^{成が不十分な}メタボリックシンドローム⁸の患者数が増えていること9にとって特に興味深いものです。しかし、CCGのプロセスとメカニズムがより深く理解されるまで、IHDの治療のためにCCGを誘導する試みは実を結ぶ可能性は低いです。

冠状動脈側副血行路は大動物モデルで研究されており、ブタ¹⁰、イヌ¹¹、およびラット¹²においてCCGを誘導するために、主要な冠状動脈の短時間の反復閉塞が用いられている。しかし、CCGのマウスモデルは、系統追跡、遺伝子特異的または細胞特異的なトランスジェニックおよびノックアウトラインなど、多くの遺伝子改変マウス系統が容易に利用できるため、CCGの分子的および細胞的メカニズムを研究する上でより多くの利点があります。興味深いことに、ヒトとは異なり、マウスは天然の冠状副血行子を持たないと報告されており^13,14、冠状動脈の側副形成を研究するための魅力的なモデルとなっています。実際、最近の報告によると、閉塞性動脈疾患の患者では、ほぼ半数(47%)が傍側血統を持っていませんでした（レントロップグレード0^）3;したがって、CCGのマウスモデルは、ネイティブの側副血行が最小限の患者に臨床的に関連性がある可能性があります。

そこで、反復性虚血によって誘発されるCCGのマウスモデルを開発し、タイマーで自動化された圧力ベースのインフレーションシステムを使用して、左前下行動脈(LAD)上のインフレータブルバルーンオクルーダーを開発しました。反復性虚血プロトコルは、最近の出版物¹⁴に示されているように、側副成長を刺激することができます。このCCGのマウスモデルは、細胞および分子レベルでのCCGのプロセスに関する新たな洞察を提供し、CCGを促進するための潜在的な標的を検証するために使用できます。

プロトコル

記載されている動物実験は、実験動物の世話と使用のためのガイドに従って実施され、ノースイーストオハイオ医科大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。

1.手術の準備

注:RIプロトコルには、体重が25g以上の雌雄のC57BL/6マウスを使用してください。手術全体を通して無菌技術を使用します。

1. セットアップ
   1. オートクレーブまたはビーズ滅菌器ですべてのツールを滅菌します。オクルーダー、テザー、PEチューブなどのデリケートな材料やインプラントをエチレンオキシド(EtO)で滅菌します。
   2. 手術部位を70%エタノールで拭いて清掃します。滅菌ドレープにすべてのツールと消耗品をレイアウトして、エリアを準備します。消耗品の完全なリストについては、 材料の表 を参照してください。
2. マウス挿管
   1. 立ち直反射が失われるまで、3%イソフルランと酸素(1 L / minの流量)でマウスに短時間麻酔をかけます。.胸部、背中の中央、右耳の後ろを剃ります。抜け毛を完全に取り除きます。グリコピロレートを0.01〜0.02 mg / kgで筋肉内に注入します。.
   2. 3%-4%イソフルランで5分間再度麻酔します。マウスを仰臥位に置き、上切歯から拘束し、鈍い鉗子を使用して舌を脇に動かします。光ファイバーライトと拡大喉頭鏡を使用して、20G血管カテーテルでマウスにすばやく挿管します。
   3. マウスの仰臥位を保温手術用パッドに置き、挿管チューブを3%イソフルランを含む小動物の人工呼吸器に接続します。リズミカルな両側の胸部上昇をチェックして、挿管を確認します。足の指のつま先つまみ反応の欠如により、適切な麻酔の深さを確認します。
3. 術野の準備
   1. 眼科用軟膏を目に塗布して乾燥を防ぎます。
   2. 剃った部分をベタジンできれいにし、次に70%エタノールで、一方向に一度拭きます。
   3. サージカルパッドの心電図(EKG)接点に電極クリームを塗布し、マウスの手足をそれらにテープで貼り付けます。マウスの下半分に滅菌ガーゼを掛けます。
   4. 手術中の呼吸数、体温、麻酔の深さを、サージカルパッドのソフトウェアインターフェースを使用して監視します。
4. 左開胸術とオクルーダー移植術
   1. イソフルランを2%に減らします。.はさみを使用して胸の皮膚に2〜3cmの正中線切開を行い、次に湾曲した鉗子を使用して、胸の左側の皮膚と筋肉の層を穏やかに分離します(図1A)。
   2. 鈍い鉗子を使用して、胸壁にそっと開口部を作り、通常は3^番目 と5^番目の 肋間骨の間に心臓を露出させます。
   3. リトラクターを使って肋骨をやさしく広げ、心臓を視覚化します。鈍い鉗子を使用して、心膜を引き裂いて心臓を露出させます。左耳介(図1B)を特定し、可能であれば左前下行動脈(LAD)の基底部分を視覚化します。
   4. 8-0をパスLADの下の心筋を通るポリプロピレン縫合糸。
      注:入口と出口の間の距離は、オクルーダーの幅とほぼ等しく、LADに対して垂直である必要があります。
   5. リトラクターを取り外します。先のとがった鉗子を使用して、オクルーダーチューブの端を胸壁を2番目の下肋間腔に通し、オクルーダーが胸腔内の心臓の上に位置するまで、オクルーダーチューブを胸壁から引き出します。
   6. 外科医の結び目(図1C)を使用してオクルーダーを心臓にしっかりと結び、オクルーダーが心臓に横たわっているが、心臓に押し込まれないようにします。
   7. 押しボタン式インフレーションデバイスを使用して、オクルーダーを10 psiで短時間膨らませます(~10秒)。心電図をチェックして、インフレーション中のST上昇を確認し、可能であれば、心臓尖のブランチングを視覚的に確認します。必要に応じて縫合糸の位置や張力を調整し、虚血を確認します。
5. 閉会
   1. 6-0ポリプロピレン縫合糸で隣接するリブを閉じ、胸部チューブを挿入します。胸部から空気と血液を排出してから、胸部チューブを取り外します。胸壁の閉じた切開部に2%リドカインを塗布します。.
   2. 先のとがった鉗子を使用して、オクルーダーチューブを右肩の皮膚の下にトンネルし、右耳の後ろの皮膚を通してチューブを外部にします。胸の筋肉を交換し、6-0ポリグラクチン縫合糸で皮膚を閉じます(図1D)。
   3. マウスを腹臥位に反転させます。手術終了の少なくとも30分前に、ケトプロフェンを3 mg / kgの投与量で皮下投与します(0.9%滅菌生理食塩水で1 mg / mL希釈を使用)。.
6. テザー移植
   1. 小さなハサミを使って、背中の中央の皮膚に小さく(1cm)切開し、皮下脂肪や筋肉組織から皮膚をやさしく分離します。
   2. オクルーダーチューブを背中の中央にある切開部にトンネルで固定し、外部に押し出し、テザーに通します。6-0縫合糸を使用して、耳の近くの小さな穴を閉じます。
   3. 6-0ポリプロピレン縫合糸を使用して、テザーを背中の筋肉に固定します(図1E)。テザーボタンの上の皮膚を6-0縫合糸で閉じます。
7. 回復
   1. マウスが自立して呼吸できるようになったら、挿管チューブを取り外します。マウスを術後RIケージに入れます(1匹の場合; 図3)足のピンチ反応が戻ったら。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを継続的に監視します。マウスが完全に動くようになるまで、ケージをヒートパッドの上に置きます。
   2. 翌日、ケトプロフェンの2回目の投与を3 mg / kgで皮下投与します。.
   3. RIプロトコルを開始する前に、マウスを5〜7日間休ませてください。マウスを毎日モニタリングして、機器の完全性を確認し、必要に応じてケージを交換します。マウスはRIプロトコルの期間中、シングルハウスであるため、必要に応じて適切な濃縮を行います。

2. 反復性虚血

1. 前述のように、RI プロトコルの 0 日目に心エコー検査によってオクルーダーの配置を確認します¹⁵。オクルーダーの膨張中の心機能の低下を観察します。
2. マウスのオクルーダーチューブをRIインフレーションシステムに接続します(図4)。システムは、オクルーダーを10psiまで6分間、1日4回膨らませ、各膨らませる間に3時間の休憩を挟みます(図5)。
3. RIの17日後、ステップ2.1のように心機能を再チェックします。

3. ポリマー灌流と組織採取

1. 犠牲時には、マウスに3%〜4%イソフルランを麻酔し、ヘパリン(500 U / kg)を腹腔内に注射します。.ノーズコーンを使用して、イソフルラン投与を2%で少なくとも5分間続け、つま先のピンチ反応がないことで麻酔の適切な深さを確認します。.
2. 胸腔を開けて、心臓と胸部大動脈を露出させます。下行胸部大動脈をPE20チューブでカニューレし、下大静脈(IVC)を二等分して流出を可能にします。IVCから出る液体が透明になるまで1x PBSで心臓を逆行性に灌流し、続いて3 mLの1%リドカイン、次に3 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSで投与します。.オクルーダーの正確な位置でLADの永久的な結紮を行います。
3. 動脈回路が満たされるまで、X線不透過性試薬で心臓を逆行性灌流します。.PE20チューブを止血剤で固定し、ポリマーを90分間硬化させます。解剖スコープで心臓をイメージします。

結果

C57BL/6マウス136匹(雌雄合わせて)のうち、RI手術の生存率は93.4%で、17日間のRIプロトコル全体で生存したマウスは80.9%でした。

マウスRIプロトコルは、心筋に永久的な損傷を伴わない虚血の短いエピソードを有する以前の動物RIモデル^12,16に基づいて最適化されました。手術中、オクルーダーの機能評価は、オクルーダーの膨張中にLV頂点の目に見えるブランチングと心電図のST上昇を観察することで行うことができます(図6)。術後の回復期間の後、閉塞器の機能は、閉塞器の膨張前と膨張中の両方で心エコー検査によって 0 日目に再度チェックされました。膨張中に駆出率(EF)と分数短縮(FS)の両方が減少し、これは閉塞器が正しく配置され、膨張中に虚血と機能低下を引き起こしていることを示しています(図7A)。これらのパラメータは、17日目に再度評価できます。図7Aに見られるように、オクルーダーの膨張中の心機能が17日間で改善した場合、オクルーダーの膨張によって誘発される虚血は、RI期間中に成長した担保によって改善され、現在、担保依存ゾーン(CZ)に再供給されていることを示唆しています。

心エコー検査による機能アッセイに加えて、CCG の別の評価は、放射線不透過性ポリマーの灌流によって側副血管の存在を視覚化することです。マウスは天然の側副産物を持たないと報告されている¹³ので、天然のマウス心臓(手術やRIなし)では、LADのライゲーションとそれに続くポリマーの逆行性灌流により、ライゲーションの下流に非充填CZ領域が生じ、流れが停止したために動脈がポリマーで満たされない(図7B)。対照的に、CZに満たされた動脈が存在することは、側副循環の存在を示しています。RIプロトコールを受けたマウスでは、オクルーダー位置でライゲーションした後、RI期間中に開発された側副血行路を介してCZにポリマーを灌流します(図7C)。

図1:主要なステップの手術図(A)皮膚と筋肉の正中線切開および収縮後の鉗子の先端で示される開胸術の位置。(B)開胸術後の心臓;黄色のアスタリスクは、左耳介の位置を示します。(C)オクルーダーを心臓に配置し(白い矢印)、および外側のチューブを第2の下肋間腔(青い矢印)に通す。(D)チェストを閉じた後の眺め。白い矢印は皮下オクルーダーチューブ、黄色の矢印は右肩のチューブが外側に配置されている場所を示しています。(E)テザーの背中への固定。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:オクルーダーを膨らませるための押しボタン装置。 インフレーションデバイスは、(A)レギュレーター、(B)電気電磁弁、(C)オン/オフプッシュボタン、および(D)圧力計で構成されています。端部(E)で先細りになり、オクルーダーチューブに接続します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:術後のマウスケージ。 コンポーネントには、(A)プラスチック製のテザースイベル、(B)カーボンファイバーチューブ、(C)スナップスイベルとシンカーで作られたカウンターバランスが含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:自動インフレーションシステム。 これは、(A)ノーマルクローズ電動ソレノイドバルブ、(B)圧力計、(C)ノーマルオープン電動ソレノイドバルブ、および(D)デジタルプログラマブルタイマーに接続された電気パネルで構成されています。タイマーがシステムをオンにすると、ソレノイドが切り替わり、CO₂ がシステムに流れ込み、オクルーダーが膨らみます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:RIプロトコルのタイムライン。 RI手術後、マウスは最初の心エコー検査とRIプロトコルの開始前に5〜7日間休息し、その後、最終的な心エコー検査と犠牲まで17日間続きます。RIプロトコルは、4つの毎日のインフレーション(それぞれ10psiで6分)で構成され、インフレーションの間に3時間の休息があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:オクルーダーの膨張前、膨張中、膨張後の代表的な心電図 (A)膨張前の心電図(赤い矢印は膨張の開始を示す)。(B)インフレ中の心電図、ST上昇を示しています。(C)心電図は、デフレ後、正常に戻った。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:冠状動脈側副成長(CCG)の評価 (A)野生型マウスでは、0日目の閉塞器膨張中に駆出率(EF)と分画短縮(FS)が減少し、正しい閉塞器の配置が示されました。17日目のEF%およびFS%の変化は0日目よりも有意に小さく、CCG(0日目のn=14、17日目のn=9、統計的有意性分析に不対応のMann-Whitney U検定を使用した、*p < 0.05)を示しています。この数値は¹⁴から変更されています。(B、C)放射線不透過性ポリマー灌流(RIの有無にかかわらず)。白い矢印はLADライゲーションポイントを示しています。白い破線の円は、担保依存ゾーン(CZ)を示します。非RIハートでは充填はありませんが、RIハートでは、CZの血管は担保を介して充填されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

冠状動脈の側副血行路は、IHD患者にとって自然なバイパスです。血管新生を標的とした臨床試験が失敗した後¹⁷、冠状動脈側副創成を促進することは、これらの患者にとってより良い治療アプローチになる可能性があります。血管新生由来の毛細血管が内皮細胞の単層しかないのに対し、側副動脈は平滑筋細胞を被覆した成熟した動脈です。側副は、閉塞性動脈によって引き起こされる心筋虚血の領域に血流を補充します。CCGの制御を理解することは、IHDを治療するための新しい標的を開発するために不可欠です。

反復虚血を用いた大動物モデルでCCGを研究することは有益であり10,11,12、特に自動化して分散を減らし、時間効率を向上させる場合¹⁸が、現在の遺伝技術を十分に活用することはできない。このようなCCGモデルをマウスのサイズに縮小することには課題がありますが、実用的かつ科学的な利点は数多くあります。マウスは飼育コストが低く、必要なスペースも少なくて済み、遺伝子モデルのツールボックスも豊富です。

近年、CCGのマウスモデルがいくつか発表されているが13,16,19,20,21、このモデルにはいくつかの特徴がある¹⁴。反復性虚血(RI)は、心筋梗塞による心筋の喪失や損傷を伴わずに、側副成長を誘発します。オクルーダー移植後、RIプロセスを調整し、プログラムを自動化することができ、これは時間効率と再現性に有益です¹⁸。自動インフレーションシステムは低コストで、コンピュータシステムを必要とせずにプログラムや操作が簡単です。側副成長は、閉塞器の膨張の有無にかかわらず心機能を測定することで評価でき、冠状動脈側副血流の存在を示す優れた代理指標です。さらに、心臓の血管系を視覚化するためのX線不透過性ポリマーによる灌流は、簡単で低コストです。全体的な手順は複雑で、熟練した外科医が必要ですが、CCGのマウスモデルは、成人の心臓における側副成長の誘導を可能にし、CCGの調節を研究するための新しい領域を開き、IHDの側副成長を促進するための治療標的をテストするためのツールを提供します。

ここに示すデータは生後4〜6か月の野生型マウスを対象としていますが、プロトコルは、遺伝子調節、性差、老化、心血管病理など、CCGに影響を与える要因の問題を探求するさまざまな研究のさまざまなニーズに適応させることができます。マウスの心臓に対するオクルーダーのサイズのため、少なくとも25gのマウスを使用することをお勧めします。また、老化はすべての心血管疾患の危険因子であり、それがCCGに与える影響は不明であることも認識しています。老齢マウスの外科的生存率または側副成長の結果は、手術の長さと複雑さ、または全身の老化表現型のために、野生型とは異なる可能性があると予想されます。

RIプロトコルの外科的準備は、2つのインプラントと手術中のマウスの再配置を含む、一般的なMI手術よりも実際に長く、複雑です。いくつかの重要なステップに注意を払うことは、プロセスを容易にするのに役立ちます。この処置の最も重要なステップは、オクルーダーの埋め込みであり、これは、縫合糸を心筋に通すときにLADを正確に外接させることと、オクルーダーに結ぶときに縫合糸の正しい張力を達成することに依存しています。オクルーダーの正確な位置決めは簡単に評価できます:配置が成功すると、オクルーダーが膨らんだときにのみ、頂端のブランチングとST上昇が発生します。そうでなければ、心筋と心電図は正常に見えます。RI手術中の心電図のインフレーションありとインフレーションなしの心電図、および0日目の手術後のインフレーションありとインフレーションなしの心機能を確認することが重要です。マウスが閉塞器の膨張を伴わない心筋梗塞を患っている場合、その動物は研究から除外されるべきです。オクルーダーを埋め込む前に、最適な圧力でテストする必要があります。テザーの埋め込みは、テザーがマウスによる損傷からオクルーダーチューブを保護するため、もう1つの重要なステップであり、RIプロトコルが早期に終了します。不適切な配置は、皮膚の壊死を引き起こす可能性があります。

要約すると、この反復性虚血を介したCCGのマウスモデルは、CCGのメカニズムと調節の研究、およびIHDの治療のために開発された治療法のスクリーニングのための貴重なツールです。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 degree forceps	Fine Science Tools	11251-35
1/4" Closed Brass Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS2-00054	inflation system
1/4" Open Brass Electric Solenoid Valve	AceCrew		inflation system
1/4" pneumatic tubing	‎China SNS Pneumatic Co.,Ltd	‎APU1/4-32.8ft	push-button device
1/4" push-in connectors	RuoFeng	543Y	push-button device
1/8" brass fittings	Edge Industrial		inflation system
2 Position Pneumatic Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS- PSV00033	push-button device
20G angiocath	BD	381703
45 degree Castroviejo needle holders	Roboz	RS-6421
6-0 polyglactin sutures	DemeTECH	G176011B13M
6-0 polypropylene sutures	AD Sugical	XS-P618R11
70% Ethanol
8-0 polypropylene sutures	DemeTECH	PM19800, 65G0P
Betadine	Purdue Products	367618150085
Blunt nosed scissors	World Precision Intruments	500366
Carbon fiber arrow shaft			post-surgical cage; cut to 12.5 cm
Cotton swabs (3")	Puritan	872-PC DBL
Curity Gauze Sponges (2x2)	Cardinal Health	2146
Dipsey swivel sinkers	Water Gremlin		post-surgical cage
Electrode cream	Signacreme	17-05
Glycopyrrolate	Westward	0143-9679-01
Hartman hemostats	Fine Science Tools	13003-10
Isoflurane	Covetrus	29404
Ketofen (ketoprofen)	zoetis	10004031
Lidocaine (2%)	Covetrus	14583
MICROFIL (yellow)	Flow Tek	MV-122
Mini Push Button	Interactivia	E-SWC-PBM-PBS-105	push-button device
Miniature Air Pressure Regulator	PneumaticPlus	PPR2-N02BG-4	push-button device
Mini-Colibri spring retractor	Fine Science Tools	17000-01
MiniVent ventilator	Harvard Apparatus	73-0044
Occluder			Custom made
Octagon handled forceps	Fine Science Tools	11041-08
Ohan Rodent Intubation System	BMR Supply	Ohan-201
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz	sc-281692
PE20 tubing
PE50 tubing
Plastic swivel (1 channel)	Instech	375/25PS	post-surgical cage
Premixed PBS Buffer, 10x	Roche	11666789001	Diluted to 1x
Pressure Gauge	PIC Gauges	102D-158D-10/32	push-button device
Programmable Digital Outlet Timer	BN-LINK	‎BND-60/SU105	inflation system
Puralube Vet Opthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38
Retractors w/ 18200-07 elastomer	Fine Science Tools	18200-10 and 18200-11
Rodent Surgical Monitor+	Scintica	900-0053-01
Round handled suture tying forceps	Fine Science Tools	18026-10
Snap-lock barrel swivel (size 5)	Eagle Claw	‎01032-005	post-surgical cage
Straight needle holders	Fine Science Tools	12060-01
Tether	Instech	PS62