반복성 허혈을 통한 관상동맥 측부 성장의 마우스 모델

요약

본 논문은 좌측 전방 하행 동맥에 공압 폐색의 외과적 이식, 반복성 허혈 프로토콜에 대한 자동 팽창 시스템 및 담보 성장을 평가하는 잠재적 방법을 포함하여 마우스에서 반복적 허혈에 의해 유도된 출생 후 관상 동맥 측부 성장을 연구하는 방법을 제시합니다.

초록

관상동맥 측부는 허혈성 심장 질환(IHD)에서 자연적으로 우회하는 요소이므로 수년 동안 관상동맥 측부 성장(CCG)은 특히 CCG가 손상된 제2형 당뇨병 또는 대사 증후군 환자에서 IHD의 유망한 치료 대상이었습니다. 그러나 이 과정은 돼지, 개, 쥐와 같은 다른 동물 모델이 확립되었음에도 불구하고 CCG의 마우스 모델이 부족하기 때문에 부분적으로 연구가 부족합니다. 마우스 모델은 계통 추적 및 유전자 조절(과발현 또는 녹아웃)을 포함하여 종에 사용할 수 있는 많은 유전자 변형을 활용하여 관련된 경로 및 세포 유형을 포함하여 CCG의 과정과 메커니즘을 설명할 수 있습니다.따라서 우리는 과도현상을 통해 반복성 허혈(RI)에 의해 유도된 CCG의 마우스 모델을 개발하기 시작했습니다. 좌측 전방 하행 동맥(LAD)의 반복적 폐색. 이 원고는 LAD에 공압 폐색을 이식하는 RI 수술, 팽창의 압력과 타이밍을 제어하는 데 사용되는 자동화된 압력 기반 팽창 시스템, RI 프로토콜의 순서를 포함하여 이 마우스 CCG 모델에 대한 세부 정보를 제공합니다. 이 방법은 RI에 의해 유도된 CCG 과정을 밝히기 위해 이미 한 건의 출판물을 작성했으며, 이는 발아 혈관 신생이 성인 마우스 심장의 CCG에서 성숙한 관상 동맥을 발생시킨다는 것을 보여줍니다.

서문

허혈성 심장질환(IHD)은 미국에서 가장 큰 사망 원인이며, 이 질환을 치료하기 위해 매년 200,000건 이상의 관상동맥 우회 수술이 시행되고 있다¹. 관상동맥 나무의 가지 사이에 있는 문합인 관상동맥 측부(coronary collaterals)는 막힌 곳 하류의 허혈성 조직에 혈액을 재공급할 수 있는 자연적인 우회회로이다²; 그러나 사람들은 자신의 모국어(native collateral network)의 정도에 큰 차이를 보인다 ^3,4. 관상동맥 측부가 더 광범위한 IHD 환자는 경색 크기 및 사망률 감소를 포함하여 심장 사건 동안 더 나은 결과를 보입니다. 따라서 관상동맥 담보 성장(CCG)은 10년 이상 치료 대상이었습니다 ^5,6,7. 이는 대사 증후군(metabolic syndrome)⁸을 앓고 있는 환자들의 수가 증가하고 있다는 점에서, 관상동맥 담^보화(coronary collateralization)가 더 좋지 않다는 점9에 특히 관심이 있다. 그러나 CCG의 과정과 메커니즘이 더 잘 이해되기 전까지는, IHD 치료를 위해 CCG를 유도하려는 시도는 성과를 거두지 못할 것입니다.

관상동맥 측부는 대형 동물 모델에서 연구되었으며, 돼지¹⁰, 개¹¹ 및 쥐¹²에서 CCG를 유도하기 위해 주요 관상동맥의 짧고 반복적인 폐색이 사용되었다. 그러나 CCG의 마우스 모델은 계통 추적, 유전자 특이적 또는 세포 특이적 형질전환 및 녹아웃 라인을 포함하여 쉽게 구할 수 있는 많은 유전적으로 변형된 마우스 라인으로 인해 CCG의 분자 및 세포 메커니즘을 연구하는 데 더 많은 이점을 가질 것입니다. 흥미롭게도, 인간과 달리, 마우스는 타고난 관상동맥 측부(coronary collaterals)^13,14가 없는 것으로 보고되어, 관상동맥 측부 형성을 연구하기 위한 매력적인 모델이다. 실제로, 최근 보고서에 따르면 폐쇄성 동맥 질환 환자의 거의 절반(47%)이 담보가 없었습니다(Rentrop grade 0)³; 따라서 CCG의 마우스 모델은 최소한의 네이티브 담보화를 가진 환자에게 임상적으로 관련성이 있을 수 있습니다.

따라서 우리는 반복적 허혈에 의해 유도된 CCG의 마우스 모델을 개발했으며, 타이머로 자동화된 압력 기반 팽창 시스템을 사용하는 좌측 전방 하강 동맥(LAD) 위에 팽창식 풍선 폐색기를 사용했습니다. 반복적 허혈 프로토콜은 최근 간행물¹⁴에서 나타난 바와 같이 담보 성장을 자극할 수 있습니다. 이 CCG 마우스 모델은 세포 및 분자 수준에서 CCG 과정에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 CCG를 촉진하기 위한 잠재적 표적을 검증하는 데 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

설명된 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며 노스이스트 오하이오 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 수술 준비

참고: RI 프로토콜의 경우 무게가 25g 이상인 암수 중 하나의 C57BL/6 마우스를 사용합니다. 수술 내내 무균 기술을 사용하십시오.

1. 설치
   1. 오토클레이브 또는 비드 살균기로 모든 도구를 살균하십시오. 오클루더(occluder), 테더(tether), PE 튜브와 같은 섬세한 재료와 임플란트를 에틸렌옥사이드(EtO)로 멸균합니다.
   2. 70% 에탄올로 모든 부위를 닦아 수술 부위를 청소합니다. 모든 도구와 용품을 멸균 커튼에 배치하여 해당 지역을 준비합니다. 소모품의 전체 목록은 재료 표를 참조하십시오.
2. 마우스 삽관
   1. 오른쪽 반사가 사라질 때까지 산소(1L/min 유속)와 함께 3% 이소플루란으로 마우스를 잠시 마취합니다. 가슴 부위, 등 중앙, 오른쪽 귀 뒤를 면도하십시오. 느슨한 머리카락을 완전히 제거합니다. 글리코피롤레이트를 0.01-0.02mg/kg으로 근육 주사합니다.
   2. 3%-4% 이소플루란으로 5분 동안 다시 마취합니다. 누운 마우스를 위쪽 앞니를 제외한 비스듬한 곳에 놓고 뭉툭한 집게를 사용하여 혀를 옆으로 움직입니다. 광섬유 조명과 확대 후두경을 사용하여 20G 혈관으로 마우스를 빠르게 삽관합니다.
   3. 앙와위를 눕힌 쥐를 보온 수술 패드에 놓고 삽관 튜브를 3% 이소플루란이 함유된 소형 동물 인공호흡기에 연결합니다. 리드미컬한 양측 흉부 상승을 확인하여 삽관을 확인합니다. 발가락 꼬집음 반응이 없어 적절한 마취 깊이를 확인합니다.
3. 수술 분야의 준비
   1. 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오.
   2. 면도한 부위를 베타딘과 70% 에탄올로 닦고 단방향으로 한 번 닦습니다.
   3. 수술 패드의 심전도(EKG) 접점에 전극 크림을 바르고 마우스의 팔다리를 테이프로 붙입니다. 마우스의 아래쪽 절반에 멸균 거즈를 드레이핑합니다.
   4. 수술 패드의 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 수술 중 호흡 속도, 온도 및 마취 깊이를 모니터링합니다.
4. 좌측 개흉술 및 폐폐 이식
   1. 이소플루란을 2%로 줄입니다. 가위를 사용하여 가슴 피부를 2-3cm 정도 정중선으로 절개한 다음 구부러진 집게를 사용하여 가슴 왼쪽의 피부와 근육층을 부드럽게 분리합니다(그림 1A).
   2. 무딘 집게를 사용하여 흉벽을 통해 부드럽게 구멍을 뚫어 일반적으로 3^번째 와 5^번째 늑간 사이에 심장을 노출시킵니다.
   3. 견인기를 사용하여 갈비뼈를 부드럽게 벌리고 심장을 시각화합니다. 무딘 집게를 사용하여 심낭을 찢어 심장을 드러냅니다. 좌측 귓바퀴(그림 1B)를 찾고 가능한 경우 좌측 전방 하행 동맥(LAD)의 기저 부분을 시각화합니다.
   4. 패스 8-0 LAD 아래의 심근을 통한 폴리프로필렌 봉합사.
      참고: 입구와 출구 사이의 거리는 폐색의 너비와 거의 같아야 하며 LAD에 수직이어야 합니다.
   5. 견인기를 제거합니다. 뾰족한 집게를 사용하여 두 번째 하늑간 공간의 흉벽을 통해 폐색 튜브의 끝을 외부화하고 폐색이 흉강 내 심장 위에 위치할 때까지 흉벽을 통해 폐색 튜브를 당겨 빼냅니다.
   6. 외과 의사의 매듭(그림 1C)을 사용하여 폐색판을 심장에 단단히 묶어 폐색판이 심장에 놓이되 심장을 누르지 않도록 합니다.
   7. 푸시 버튼 팽창 장치를 사용하여 10psi에서 폐색기(~10초)를 짧게 팽창시킵니다(그림 2). 심전도를 확인하여 팽창 중 ST 상승을 확인하고 가능한 경우 심장 정점의 희미함을 육안으로 확인합니다. 허혈을 확인하기 위해 필요에 따라 봉합사의 위치나 장력을 조정합니다.
5. 결산
   1. 6-0 폴리프로필렌 봉합사로 측면 갈비뼈를 닫고 흉관을 삽입합니다. 흉부에서 공기와 혈액을 배출한 다음 흉관을 제거합니다. 흉벽의 닫힌 절개 부위에 2% 리도카인을 바릅니다.
   2. 뾰족한 집게를 사용하여 오른쪽 어깨 피부 아래에 가림막 튜브를 뚫어 오른쪽 귀 뒤의 피부를 통해 튜브를 외부로 만듭니다. 흉부 근육을 교체하고 6-0 폴리글락틴 봉합사로 피부를 봉합합니다(그림 1D).
   3. 마우스를 엎드린 위치로 뒤집습니다. 수술 종료 최소 30분 전에 3mg/kg(0.9% 멸균 식염수에 1mg/mL 희석액 사용)의 용량으로 케토프로펜을 피하 투여합니다.
6. 테더 이식
   1. 작은 가위를 사용하여 등 중앙의 피부를 1cm씩 작게 절개하여 피하 지방과 근육 조직에서 피부를 부드럽게 분리합니다.
   2. 폐색 튜브를 등 중앙의 절개 부위까지 터널을 뚫고 외부로 만든 다음 밧줄을 통해 끼웁니다. 6-0 봉합사를 사용하여 귀 근처의 작은 구멍을 막습니다.
   3. 6-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 밧줄을 등 근육에 고정합니다(그림 1E). 6-0 봉합사로 테더 버튼 위의 피부를 닫습니다.
7. 복구
   1. 마우스가 독립적으로 숨을 쉴 수 있게 되면 삽관 튜브를 제거합니다. 수술 후 RI 케이지에 마우스를 넣습니다(단일 동물의 경우; 그림 3) 일단 발 꼬집음 반응이 돌아왔습니다. 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 지속적으로 모니터링합니다. 마우스가 완전한 이동성을 회복할 때까지 케이지를 열 패드에 놓습니다.
   2. 다음날, 케토프로펜을 3mg/kg씩 피하주사로 2차 투여합니다.
   3. RI 프로토콜을 시작하기 전에 5-7일 동안 마우스를 쉬게 합니다. 기기의 무결성을 위해 매일 마우스를 모니터링하고 필요에 따라 케이지를 교체하십시오. RI 프로토콜 기간 동안 마우스는 단일 수용되므로 필요에 따라 적절한 농축을 제공합니다.

2. 재발성 허혈

1. 앞서 설명한 대로 RI 프로토콜의 Day 0에 심장초음파를 통해 폐색체의 위치를 확인합니다¹⁵. 폐색체가 팽창하는 동안 심장 기능이 감소하는 것을 관찰합니다.
2. 마우스의 오클루더 튜브를 RI 팽창 시스템에 연결합니다(그림 4). 시스템은 하루 4회, 6분 동안 오클루더를 10psi로 팽창시키며, 각 팽창 사이에 3시간의 휴식을 취합니다(그림 5).
3. RI 17일 후 2.1단계와 같이 심장 기능을 다시 확인합니다.

3. 중합체 관류 및 조직 추수

1. 희생 시 3%-4% 이소플루란으로 마우스를 마취하고 헤파린(500 U/kg)을 복강내로 주사합니다. 콧방울을 사용하여 최소 5분 동안 2%로 이소플루란 투여를 계속한 다음 발가락 꼬집음 반응이 없어 적절한 마취 깊이를 확인합니다.
2. 흉강을 열어 심장과 흉부 대동맥을 노출시킵니다. 하행 흉부 대동맥을 PE20 튜브로 캐뉼레이션하고 하대정맥(IVC)을 이등분하여 유출을 허용합니다. IVC에서 나오는 액체가 맑아질 때까지 1x PBS로 심장을 역행적으로 관류한 다음 1% 리도카인 3mL, PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA) 3mL를 투여합니다. 폐색기의 정확한 위치에서 LAD의 영구적인 결찰을 만듭니다.
3. 동맥 회로가 채워질 때까지 방사선 불투과성 시약으로 심장을 역행적으로 관류합니다. PE20 튜브를 지혈기로 고정하고 폴리머가 90분 동안 경화되도록 합니다. 해부 내시경으로 심장을 이미지화합니다.

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결과

수컷과 암컷을 포함한 136마리의 C57BL/6 마우스 중 RI 수술의 생존율은 93.4%였으며, 17일간의 RI 프로토콜 전체에서 80.9%가 생존했다.

마우스 RI 프로토콜은 심근에 영구적인 손상 없이 허혈이 짧게 나타나는 이전 동물 RI 모델^12,16을 기반으로 최적화되었습니다. 수술 중 폐색의 기능 평가는 폐색이 팽창하는 동안...

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토론

관상동맥 측부는 IHD 환자에게 자연스러운 우회 수단입니다. 혈관신생을 대상으로 한 임상시험이 실패한 후,¹⁷ 관상동맥 측부 개발을 촉진하는 것이 이러한 환자에게 더 나은 치료 접근법이 될 수 있다. 혈관 신생에서 유래 한 모세 혈관과 달리 내피 세포의 단일 층 만 가지고있는 측부는 평활근 세포를 덮고있는 성숙한 동맥입니다. 담보는 폐쇄성 동맥으...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 degree forceps	Fine Science Tools	11251-35
1/4" Closed Brass Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS2-00054	inflation system
1/4" Open Brass Electric Solenoid Valve	AceCrew		inflation system
1/4" pneumatic tubing	‎China SNS Pneumatic Co.,Ltd	‎APU1/4-32.8ft	push-button device
1/4" push-in connectors	RuoFeng	543Y	push-button device
1/8" brass fittings	Edge Industrial		inflation system
2 Position Pneumatic Electric Solenoid Valve	U.S. Solid	USS- PSV00033	push-button device
20G angiocath	BD	381703
45 degree Castroviejo needle holders	Roboz	RS-6421
6-0 polyglactin sutures	DemeTECH	G176011B13M
6-0 polypropylene sutures	AD Sugical	XS-P618R11
70% Ethanol
8-0 polypropylene sutures	DemeTECH	PM19800, 65G0P
Betadine	Purdue Products	367618150085
Blunt nosed scissors	World Precision Intruments	500366
Carbon fiber arrow shaft			post-surgical cage; cut to 12.5 cm
Cotton swabs (3")	Puritan	872-PC DBL
Curity Gauze Sponges (2x2)	Cardinal Health	2146
Dipsey swivel sinkers	Water Gremlin		post-surgical cage
Electrode cream	Signacreme	17-05
Glycopyrrolate	Westward	0143-9679-01
Hartman hemostats	Fine Science Tools	13003-10
Isoflurane	Covetrus	29404
Ketofen (ketoprofen)	zoetis	10004031
Lidocaine (2%)	Covetrus	14583
MICROFIL (yellow)	Flow Tek	MV-122
Mini Push Button	Interactivia	E-SWC-PBM-PBS-105	push-button device
Miniature Air Pressure Regulator	PneumaticPlus	PPR2-N02BG-4	push-button device
Mini-Colibri spring retractor	Fine Science Tools	17000-01
MiniVent ventilator	Harvard Apparatus	73-0044
Occluder			Custom made
Octagon handled forceps	Fine Science Tools	11041-08
Ohan Rodent Intubation System	BMR Supply	Ohan-201
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz	sc-281692
PE20 tubing
PE50 tubing
Plastic swivel (1 channel)	Instech	375/25PS	post-surgical cage
Premixed PBS Buffer, 10x	Roche	11666789001	Diluted to 1x
Pressure Gauge	PIC Gauges	102D-158D-10/32	push-button device
Programmable Digital Outlet Timer	BN-LINK	‎BND-60/SU105	inflation system
Puralube Vet Opthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38
Retractors w/ 18200-07 elastomer	Fine Science Tools	18200-10 and 18200-11
Rodent Surgical Monitor+	Scintica	900-0053-01
Round handled suture tying forceps	Fine Science Tools	18026-10
Snap-lock barrel swivel (size 5)	Eagle Claw	‎01032-005	post-surgical cage
Straight needle holders	Fine Science Tools	12060-01
Tether	Instech	PS62