结合颅骨窗变薄和液体叩击的重复性轻度创伤性脑损伤改良小鼠模型

摘要

该方案提出了一种通过闭合性颅脑损伤 （CHI） 方法诱导的重复性轻度创伤性脑损伤 （rmTBI） 的改良小鼠模型。该方法的特点是薄颅骨窗和液体叩击，以减少通常由脑膜暴露引起的炎症，同时提高了啮齿动物 rmTBI 建模的可重复性和准确性。

摘要

轻度创伤性脑损伤是一种临床上高度异质性的神经系统疾病。迫切需要具有明确病理学的高度可重复的创伤性脑损伤 （TBI） 动物模型来研究轻度 TBI 后的神经病理学机制和测试治疗方法。事实证明，在动物模型中复制 TBI 的整个后遗症是一项挑战。因此，TBI 的多种动物模型的可用性对于解释 TBI 患者的不同方面和严重程度是必要的。CHI 是制造 rmTBI 啮齿动物模型的最常见方法之一。然而，这种方法容易受到许多因素的影响，包括所使用的冲击方法、颅骨的厚度和形状、动物呼吸暂停以及使用的头部支撑和固定类型。该协议的目的是证明薄颅骨窗和液体叩击损伤 （FPI） 方法的结合，以产生 CHI 相关 rmTBI 的精确小鼠模型。该协议的主要目标是最大限度地减少可能影响 CHI 和 FPI 建模准确性和一致性的因素，包括颅骨厚度、形状和头部支撑。通过使用减薄颅骨窗方法，最大限度地减少了开颅手术和 FPI 引起的潜在炎症，从而产生了改进的小鼠模型，复制了在轻度 TBI 患者中观察到的临床特征。使用苏木精和伊红 （HE） 染色的行为和组织学分析结果表明，rmTBI 可导致累积损伤，从而产生大脑行为和大体形态的变化。总体而言，改良的 CHI 相关 rmTBI 为研究人员提供了一个有用的工具，以探索导致 rmTBI 局灶性和弥漫性病理生理变化的潜在机制。

引言

轻度 TBI，包括脑震荡和亚脑震荡，占所有 TBI 病例的大多数（占所有 TBI 的 >80%）¹。轻度 TBI 通常由跌倒、交通事故、暴力行为、接触性运动（例如足球、拳击、曲棍球）和军事战斗引起 ^2,3。轻度 TBI 可导致神经生物学事件，影响患者一生中的神经行为功能，并增加患神经退行性疾病的风险 ^4,5,6。动物模型为研究轻度 TBI 提供了一种有效且可控的方法，有望进一步加强轻度 TBI 的诊断和治疗。已经开发了各种轻度 TBI 模型，例如受控皮质冲击 （CCI）、体重下降 （WD）、液体叩击伤 （FPI） 和爆炸性 TBI 模型 ^7,8。没有一个单一的实验模型可以模拟 TBI 诱导病理的全部复杂性 ^9,10。这些模型的异质性有利于解决与轻度 TBI 患者相关的各种特征并研究相应的细胞和分子机制。然而，每种 TBI 动物模型都有其局限性³，限制了我们目前对动物轻度 TBI 及其临床相关性的了解。

WD 和 CCI 模型用于复制临床状况，例如脑组织丢失、急性硬膜下血肿、轴索损伤、脑震荡、血脑屏障功能障碍，甚至 TBI 后昏迷 ^3,11,12。WD 模型涉及通过用自由下落的重物敲击硬脑膜或颅骨来诱导脑损伤。负重物体对完整颅骨的撞击可以复制混合的局灶性/弥漫性损伤;然而，这种方法与受伤部位的准确性和可重复性差、反弹性损伤以及颅骨骨折导致的较高死亡率有关 ^3,11,12。CCI 模型涉及应用空气驱动的金属直接撞击暴露的硬脑膜。与 WD 模型相比，CCI 模型更准确且可重复，但由于撞击尖端¹¹ 的直径较小，它不会产生弥漫性损伤。在 FPI 建模过程中，脑组织会因叩击而短暂移位和变形。FPI 可诱发混合局灶性/弥漫性损伤，并复制 TBI 后颅内出血、脑肿胀和进行性灰质损伤。然而，由于脑干损伤和长时间呼吸暂停，FPI 的死亡率很高 ^3,12。传统 WD、CCI 和 FPI 模型中涉及的开颅手术可导致皮质挫伤、出血性病变、血脑屏障损伤、免疫细胞浸润、神经胶质细胞活化、建模时间延长以及可能的致命后果 ^3,12。

轻度 TBI 的特征是 GCS（格拉斯哥昏迷量表，GCS）评分在 13 至 15 2^之间。轻度 TBI 可以是局灶性的或弥漫性的，与急性损伤有关，例如细胞稳态破坏、兴奋性毒性、葡萄糖耗竭、线粒体功能障碍、血流紊乱和轴突损伤，以及亚急性损伤，包括轴突损伤、神经炎症和神经胶质增生 ^2,3。尽管在描述 TBI 错综复杂的病理生理学方面取得了重大进展，但轻度 TBI/rmTBI 的潜在机制仍然难以捉摸，需要进一步研究⁹。鉴于 CHI 是最常见的 TBI^{类型 12}，该协议提出了一种新方法，使用改进的 FPI 设备在变薄的颅骨窗口中执行冲击，从而创建更精确控制的 rmTBI 小鼠模型¹³。通过避免开颅手术引起的损伤、可变的颅骨厚度和形状引起的不准确以及反弹损伤，这种方法旨在克服与 WD、CCI 和 FPI 模型相关的主要缺点。对变薄的颅骨窗口施加 FPI 影响有助于评估 rmTBI 后的脑血管损伤，并有助于最大限度地降低某些模型的高死亡率，从而与 TBI 患者的临床特征更相似。

研究方案

本协议中涉及的所有程序均在机构动物护理和使用委员会的批准（浙江师范大学，许可证号，dw2019005）下进行，并符合 ARRIVE 和 NIH 实验动物护理和使用指南。技术规格可在 材料表中找到。

1. 动物处理程序

1. 将小鼠置于温度为 22-24 °C、湿度为 40%-60% 的受控环境中，12 小时的光照/黑暗循环 ，并随意 提供水和标准小鼠食物。出于本实验的目的，使用了 25 只 ICR 雄性小鼠 （25-30 g，8 周龄）。
2. 将小鼠随机分配到对照组 （n=12） 或 rmTBI 组 （n=13）。为防止假小鼠对接受 rmTBI 的小鼠产生潜在攻击性，请将它们分开在不同的笼子中。
3. 在开始实验之前，给小鼠至少 1 周的时间来适应它们的笼子环境。这个适应期确保小鼠熟悉周围环境，并最大限度地减少压力或焦虑对研究期间生理或行为反应的潜在影响。

2. TBI 装置的制备

1. 使用改进的 FPI 设备在小鼠中制造 rmTBI 模型（参见 材料表; 图 1A）¹³. 在使用 FPI 设备之前，请仔细检查所有连接是否有泄漏或破裂的迹象，特别注意气瓶和管道之间以及三通连接器和管道之间的连接处。为了准确确定冲击压力，将压力传感器安装在流体冲击损伤装置¹³ 的撞击点。
2. 仔细检查 FPI 装置，以确保活塞在气缸内平稳移动，并且可以有效地进行冲击（图 1B）。验证系统内是否没有气泡。如果检测到气泡，请使用 50 mL 注射器小心地将蒸馏水加入系统中，并通过快速推动气瓶杆穿过附近的 3 通连接器和/或注射器来排出气泡。
   注意:FPI 系统由气瓶内的蒸馏水和连接的管道组成。在操作前校准设备以确保结果的准确性和可靠性至关重要。

3. 瘦头骨准备

注意:鉴于其他小鼠，不应进行动物手术和瘦颅骨制备。变薄的颅骨窗有助于评估 FPI 手术后的脑血管损伤。

1. 遵守动物中心的要求，指导实验操作员在所有动物处理程序中穿着无菌长袍和面罩。
2. 在开始实验之前，使用 70% 乙醇喷雾剂对实验室工作台、FPI 设备、麻醉管和相邻的柜台空间进行消毒。
3. 手术前称量假组和 rmTBI 组中的小鼠，并将其体重与实验前 1 周记录的体重进行比较。从研究中排除任何健康状况不佳的小鼠，例如粗糙的皮毛、腹泻、体重减轻或嗜睡。此外，排除体重小于 20 g 的小鼠，以确保它们能够承受反复撞击。这些措施对于维护动物福利和确保可靠的实验结果至关重要。
4. 在诱导室中用 4%-5% 异氟醚（在 100% 氧气中，流速为 1 L/min）麻醉小鼠 3-4 分钟。在动物的眼睛上涂抹眼用润滑剂（见 材料表），以在整个手术过程中保持润滑。为了减轻疼痛，麻醉前 20 分钟在耳朵之间的中点皮下注射丁丙诺啡 （0.05 mg/kg），随后每 6 小时给药一次，持续 24 小时。此外，在麻醉结束时，对每只动物施用单次皮下剂量的 5 mg/kg 卡洛芬。
5. 在鼠标失去扶正和踏板退出反射后对头部进行消毒。用手术剪刀修剪鼠标头上的皮毛，然后用剃须刀去除剩余的皮毛。连续三次使用 2% 洗必泰对头皮进行消毒，并穿插 75% 乙醇磨砂膏。
6. 在动物下方和周围区域放置一次性无菌手术垫，以确保适当的卫生。使用细小手术剪刀沿着小鼠头皮的中线做一个 1.5 厘米的切口，以完全暴露手术部位（图 2A）。
7. 使用传统立体定位框架中的非末端耳杆固定鼠标（参见 材料表）。根据将要研究的特定目标区域，将立体定位框架中的鼠标头位置调整为平坦水平或略微倾斜的角度。清洁手术区域的皮毛，以避免以后发炎。
8. 使用常规的恒温加热垫将小鼠的体温保持在 37 °C（参见 材料表）。
9. 在手术和冲击集线器（母鲁尔锁）安装过程中，使用鼻锥保持小鼠麻醉（对脚趾或尾巴挤压没有反应），鼻锥提供连续 2% 的异氟醚浓度，由校准的蒸发器调节。
10. 使用浸有无菌盐水的棉签仔细清洁变薄的颅骨窗周围的手术区域。
11. 使用平头微钻头（参见 材料表， 图 2B）和显微外科刀片在右额叶运动皮层中创建一个直径约为 2.5 毫米、厚度为 20 μm 的薄颅骨窗口。将手术部位定位在前囟前 1.5 毫米和中线外侧 1.3-2.0 毫米处（图 2C）。
    1. 为防止微钻在创建减薄的颅骨窗口期间穿透颅骨，请在使用微钻研磨时间歇性地用盐水润湿颅骨。
    2. 用细注射器针头的扁平尖端轻轻探查变薄的颅骨并评估其柔软度，以确认颅骨的厚度。目测估计暴露的皮质微血管的清晰度，以确定颅骨的厚度。
    3. 为了验证颅骨的厚度，将无菌盐水涂抹在变薄的区域，并使用传统的解剖显微镜目视检查（见 材料表）。这项技术有助于确保颅骨已充分变薄。
       注意:在整个瘦颅骨制备和 rmTBI 建模过程中润滑小鼠眼睛，以防止干燥。将颅骨减薄到 15 μm 以下会带来轻度皮质创伤的风险，这可能导致轻度皮质炎症¹⁴。
12. 将调整后的母鲁尔锁（内径 2.2 毫米，由 19G 针座制成，如图 2D 所示）连接到变薄的颅骨部位。用胶水和牙科水泥固定鲁尔锁（图 2E）。
    注意:当使用胶水将母鲁尔锁固定到变薄的头骨窗周围区域时，彻底擦干头骨区域并防止胶粘剂进入窗本身至关重要。窗口内的胶粘剂可以显著降低 FPI 的冲击力。

4. CHI 相关的 rmTBI 建模程序

1. 如前所述，使用外侧液体叩击法和改进的 FPI 设备引入 ^{rmTBI 13,15}。
2. 完成减薄颅骨窗口和撞击中心程序后，将鼠标从立体定位装置转移到撞击器平台。
3. 鉴于麻醉对叩诊后动物扶正反射时间和受伤严重程度的潜在影响 ^9,16，通过评估睑和爪退反射来监测麻醉深度（图 2F）。
4. 将粘在薄颅骨窗口上的母鲁尔锁连接到 FPI 设备管末端的公鲁尔锁（图 2G）。
   注意:在 rmTBI 建模中，由于叩诊诱导呼吸暂停和失去知觉，小鼠异氟醚诱导的麻醉时间延长。
5. 使用修改后的装置引入两个轻度 TBI（间隔 48 小时）。在完成减薄颅窗手术并安装 Luer Lock 后立即施加第一次 FPI 冲击。只有在鼠标每次都显示撤退反射返回爪子捏时，才施用 FPI 影响（图 2H）。对深度麻醉的小鼠施加 FPI 影响会导致长时间呼吸暂停和死亡。
   1. 要施加 FPI 冲击，请沿设备上的量角器将钟摆升高到指定度，然后使用软件控制^13,15 释放钟摆。撞击应达到 2.0 ± 0.1 atm 的叩击强度，遵循啮齿动物研究中使用的既定方案 10,17,18。如果撞击在 1.9-2.1 个大气压之间没有记录，或者在 FPI 期间发生颅骨骨折，则将动物排除在进一步测试之外。
   2. 对于假小鼠，请将它们固定在设备上，但不要产生冲击。
6. 撞击后，立即断开 Luer Lock 连接，并将鼠标转移到等温加热垫上进行恢复。老鼠恢复警觉和意识后，将其放回笼子，不要取下母鲁尔锁。48 小时后，以相同的方式施用第二次 FPI 影响。
7. rmTBI 后，小心地取下母鲁尔锁和牙科粘接剂。使用组织粘合剂缝合头皮，并使用扁平镊子捏住头皮以促进粘合过程（见 材料表; 图 2I）。
8. 为了预防炎症、感染并减轻术后疼痛和不适，将红霉素和双氯芬酸钠软膏的混合物以 1:1 的比例涂抹在伤口上（见 材料表）。将小鼠转移到等温加热垫上进行恢复。
9. 记录扶正反射的持续时间，从鼠标从立体定位装置中取出并横向放置在 FPI 的撞击器平台上时开始，一直持续到鼠标可以独立直立。
10. 老鼠恢复警觉和意识后，将其放回笼子。小鼠通常完全清醒，能够在受伤后 1.5 小时内行走。
11. 在 TBI 建模后的几天内，观察小鼠的各种迹象，包括呼吸模式、鼻子和嘴巴周围粘液的存在以及伤口区域的发红、肿胀、渗出物或重新开放。将具有上述一种或多种异常症状的动物排除在研究之外。
    注意:AAV-GCaMP6 的预显微注射允许使用双光子激光扫描显微镜通过变薄的颅骨窗口观察受伤皮层中的潜在神经元 Ca2 + 稳态和兴奋性¹⁵。

5. 莫里斯水迷宫 （MWM） 测试

注意:MWM（参见 材料表）是一种被广泛认可的方法，用于评估 TBI 后小鼠的空间学习和记忆缺陷。

1. 从受伤后 7 天 （DPI） 开始进行 MWM 测试。MWM 的圆形水池直径为 120 cm，高度为 50 cm，水温保持在 25 °C。 将圆形水池分为四个象限，逃生平台是一个直径为 6 厘米、高度为 30 厘米的圆形平台，在东北象限浸没在水面以下 1 厘米处。
2. 将相机直接放置在圆形池的正上方，以记录小鼠的运动轨迹。在小鼠的背上用黑色胶带标记它们，以方便图像采集软件识别和数据记录，包括潜伏期、游泳距离和运动轨迹。
3. 将老鼠放入水中，面向四个象限中的每一个象限的内壁，每个象限一次。一旦老鼠找到平台，让它们在那里休息 10 秒。如果鼠标在 60 秒内找不到平台，请操作员引导鼠标找到平台，让鼠标在平台上停留 10 秒，然后放回笼子休息。
4. 对每只小鼠重复每天 4 次采集试验。采集试验后，在 12 DPI 上，进行 60 秒的空间探测实验，记录小鼠穿过原始平台区域的次数和小鼠在平台所在象限停留的持续时间。
5. 每次试验后，在从 DPI 7 到 DPI 11 的 60 秒采集试验中，用毛巾快速擦干小鼠或放在暖灯下以保持小鼠体温并防止体温过低。
6. 完成上述实验程序后，用戊巴比妥（45 mg/kg，ip）以 13 DPI 麻醉小鼠。经心灌注等渗盐水，然后在磷酸盐缓冲盐水 （pH 7.2） 中灌注 4% 多聚甲醛。检索用于常规 HE 染色的大脑，以评估大体皮质和海马形态改变。HE 染色方案的详细说明可在以前的出版物中找到^13,15。
7. 完成所有实验后，如果不需要小鼠样品，则通过注射过量的戊巴比妥 （≥100 mg/kg， ip） 对小鼠实施安乐死。在收获组织或处理尸体之前，监测小鼠直到至少 60 秒没有心跳。

结果

本研究中描述的方案概述了一种通过减薄颅骨窗口诱导 rmTBI 的方法，该方法为在常规叩诊 TBI 建模期间由开颅手术准备引起的脑损伤提供了一种解决方案。通过将这种改进的流体冲击程序与改进的设备一起使用，提高了 FPI 冲击的精度和可重复性¹³。改良的撞击器具有多功能性，可用于 CHI 和 FPI 建模，无论是否进行颅骨开颅手术。此外，通过调整损伤参数（例如冲击摆的下降角?...

讨论

TBI 是指两种主要类型，闭合性和穿透性，后者的特点是颅骨和硬脑膜破裂。临床数据表明，CHI 比穿透伤更普遍 ^1,2。在单次轻度 TBI 后，大多数患者会出现 PCS 症状，这些症状通常会在短时间内消退，并且关于 PCS 发展为长期后遗症的患者比例存在争议^23,24。因此，研究人员已将重点转移到重复的 CHI 模型上，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% ethanol	Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.	220502
Buprenorphine hydrochloride	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd	H12020272	Solution, Analgesic
Carprofen	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Powder, Analgesic
Chlorhexidine digluconate	Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.	18472-51-0	19%-21% aqueous solution, Antimicrobial
Dental cement and solvent kit	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3#	Powder reconsituted in matching solvent
Dissecting microscope	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Erythromycin ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	220412	Antibiotic
Fiber Optic Cold Light Source	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
Flat-tipped micro-drill bit	Shenzhen RWD Life Science Inc.	HM31008	2 mm, steel
FPI device software	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR mice	Jinhua Laboratory Animal Center	Stock#2023091	25 Male mice, 25-30g, 8 weeks old
Isoflurane	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.	2023090501
Isothermal heating pad	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Custom made using a 19G needle hub
Micro hand-held skull drill	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38,000rpm
Modified FPI device	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris water maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63031	Evaluate mouse spatial learning and memory abilities
Open field	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Evaluate mouse locomoation and anxiety
Ophthalmic lubricant	Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.	SC230724B
Sodium diclofenac ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	221207	nonsteroidal anti-inflammatory drug
Small animal anesthesia system-Enhanced	Shenzhen RWD Life Science Inc.	R530IP
Smart video-tracking system	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	Animal tracking and analysis
Stereotactic frame	Shenzhen RWD Life Science Inc.	68043
Vetbond Tissue Adhesive	3M, St Paul, MN, USA	202402AX	Suture the animal wound
Y maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Evaluate mouse spatial working memory