Modelo de camundongo modificado de lesão cerebral traumática leve repetitiva incorporando janela de crânio afinado e percussão fluida

Resumo

Este protocolo apresenta um modelo de camundongo modificado de lesão cerebral traumática leve repetitiva (rmTBI) induzida por um método de traumatismo cranioencefálico fechado (CHI). A abordagem apresenta uma janela de crânio afinado e percussão de fluido para reduzir a inflamação comumente causada pela exposição às meninges, juntamente com melhor reprodutibilidade e precisão na modelagem de rmTBI em roedores.

Resumo

O traumatismo cranioencefálico leve é um distúrbio neurológico clinicamente altamente heterogêneo. Modelos animais de traumatismo cranioencefálico (TCE) altamente reprodutíveis com patologias bem definidas são urgentemente necessários para estudar os mecanismos da neuropatologia após TCE leve e testar terapêuticas. Replicar todas as sequelas do TCE em modelos animais provou ser um desafio. Portanto, a disponibilidade de vários modelos animais de TCE é necessária para levar em conta os diversos aspectos e gravidades observados em pacientes com TCE. CHI é um dos métodos mais comuns para fabricar modelos de roedores de rmTBI. No entanto, este método é suscetível a muitos fatores, incluindo o método de impacto usado, a espessura e a forma do osso do crânio, a apneia animal e o tipo de apoio de cabeça e imobilização utilizados. O objetivo deste protocolo é demonstrar uma combinação dos métodos de janela de crânio afinado e lesão por percussão de fluido (FPI) para produzir um modelo preciso de camundongo de rmTBI associado a CHI. O objetivo principal deste protocolo é minimizar os fatores que podem afetar a precisão e a consistência da modelagem CHI e FPI, incluindo espessura, forma e suporte de cabeça do osso do crânio. Ao utilizar um método de janela de crânio afinado, a inflamação potencial devido à craniotomia e FPI é minimizada, resultando em um modelo de camundongo aprimorado que replica as características clínicas observadas em pacientes com TCE leve. Os resultados do comportamento e da análise histológica usando coloração de hematoxilina e eosina (HE) sugerem que o rmTBI pode levar a uma lesão cumulativa que produz alterações no comportamento e na morfologia macroscópica do cérebro. No geral, o rmTBI associado ao CHI modificado apresenta uma ferramenta útil para os pesquisadores explorarem os mecanismos subjacentes que contribuem para alterações fisiopatológicas focais e difusas no rmTBI.

Introdução

O TCE leve, incluindo concussão e subconcussão, é responsável pela maioria de todos os casos de TCE (>80% de todos os TCE)¹. O TCE leve geralmente resulta de quedas, acidentes de trânsito, atos de violência, esportes de contato (por exemplo, futebol, boxe, hóquei) e combate militar ^2,3. O TCE leve pode levar a eventos neurobiológicos que afetam as funções neurocomportamentais ao longo da vida do paciente e aumentam o risco de doenças neurodegenerativas ^4,5,6. Os modelos animais fornecem um meio eficiente e controlado para estudar o TCE leve, com a esperança de melhorar ainda mais o diagnóstico e o tratamento do TCE leve. Vários modelos para TCE leve foram desenvolvidos, como os modelos de impacto cortical controlado (ICC), queda de peso (WD), lesão por percussão de fluidos (FPI) e TCE explosiva ^7,8. Nenhum modelo experimental único pode mimetizar toda a complexidade da patologia induzida por TCE ^9,10. A heterogeneidade desses modelos é vantajosa para abordar as diversas características associadas a pacientes com TCE leve e investigar os mecanismos celulares e moleculares correspondentes. No entanto, cada modelo animal de TCE tem suas limitações³, limitando nosso conhecimento atual sobre o TCE leve em animais e sua relevância clínica.

Os modelos WD e CCI são utilizados para replicar condições clínicas como perda de tecido cerebral, hematoma subdural agudo, lesão axonal, concussão cerebral, disfunção da barreira hematoencefálica e até coma após TCE ^3,11,12. O modelo WD envolve a indução de danos cerebrais ao atingir a dura-máter ou o crânio com pesos em queda livre. O impacto de um objeto pesado sobre um crânio intacto pode replicar lesões focais/difusas mistas; no entanto, esse método está associado a baixa precisão e repetibilidade do local da lesão, lesão por rebote e maior taxa de mortalidade por fraturas cranianas ^3,11,12. O modelo CCI envolve a aplicação de metal movido a ar para impactar diretamente a dura-máter exposta. Comparado ao modelo WD, o modelo CCI é mais preciso e reprodutível, mas não produz lesão difusa devido ao pequeno diâmetro da ponta impactante¹¹. Durante a modelagem FPI, o tecido cerebral é brevemente deslocado e deformado por percussão. A FPI pode induzir lesão focal/difusa mista e replicar hemorragia intracraniana, edema cerebral e danos progressivos à substância cinzenta após LCT. No entanto, o FPI tem uma alta taxa de mortalidade devido a danos no tronco encefálico e apneia prolongada ^3,12. A craniotomia envolvida nos modelos convencionais WD, CCI e FPI pode levar a contusão cortical, lesões hemorrágicas, danos à barreira hematoencefálica, infiltração de células imunes, ativação de células gliais, tempo de modelagem prolongado e possíveis desfechos fatais ^3,12.

O TCE leve é caracterizado por uma pontuação na escala de coma de Glasgow (escala de coma de Glasgow, na sigla em inglês) na faixa de 13 a 15². O TCE leve pode ser focal ou difuso e está associado a lesões agudas, como quebra da homeostase celular, excitotoxicidade, depleção de glicose, disfunção mitocondrial, distúrbio do fluxo sanguíneo e dano axonal, bem como lesões subagudas, incluindo dano axonal, neuroinflamação e gliose ^2,3. Apesar do progresso significativo no delineamento da intrincada fisiopatologia do TCE, os mecanismos subjacentes do TCE / rmTBI leve permanecem indescritíveis e requerem mais investigações⁹. Dado que o CHI é o tipo mais comum de TCE¹², este protocolo apresenta uma nova abordagem para criar um modelo de camundongo controlado com mais precisão de rmTBI usando um dispositivo FPI modificado para realizar o impacto em uma janela de crânio afinado¹³. Ao evitar lesões induzidas por craniotomia, espessura variável do crânio e imprecisões induzidas pela forma e lesão de rebote, essa abordagem visa superar as principais desvantagens associadas aos modelos WD, CCI e FPI. A aplicação do impacto do FPI na janela do crânio afinado é conveniente para avaliar o dano dos vasos cerebrais após o rmTBI e ajuda a minimizar as altas taxas de mortalidade em alguns modelos, resultando em uma maior semelhança com as características clínicas dos pacientes com TCE.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvidos neste protocolo foram realizados sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Universidade Normal de Zhejiang, Número da Licença, dw2019005) e em conformidade com o ARRIVE e o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. As especificações técnicas podem ser encontradas na Tabela de Materiais.

1. Procedimento de manipulação dos animais

1. Abrigar ratos em um ambiente controlado com temperatura de 22-24 °C, umidade variando de 40% a 60%, um ciclo claro/escuro de 12 h e fornecer acesso ad libitum à água e ração padrão para ratos. Para o propósito deste experimento, 25 camundongos machos ICR (25-30 g, 8 semanas de idade) foram usados.
2. Aloque aleatoriamente os camundongos no grupo controle (n = 12) ou no grupo rmTBI (n = 13). Para evitar a agressão potencial de camundongos simulados contra camundongos submetidos a rmTBI, separe-os em gaiolas distintas.
3. Dê aos ratos pelo menos 1 semana para se aclimatarem ao ambiente da gaiola antes de iniciar o experimento. Esse período de aclimatação garante que os camundongos se familiarizem com o ambiente e minimiza os impactos potenciais do estresse ou ansiedade nas respostas fisiológicas ou comportamentais durante o estudo.

2. Preparação do dispositivo TBI

1. Fabricar o modelo rmTBI em camundongos usando um dispositivo FPI modificado (ver Tabela de Materiais; Figura 1A) ¹³. Antes de usar o dispositivo FPI, inspecione cuidadosamente todas as conexões quanto a sinais de vazamento ou rachaduras, prestando atenção especial às junções entre o cilindro e a tubulação e entre o conector de três vias e a tubulação. Para determinar as pressões de impacto com precisão, um transdutor de pressão foi instalado até o ponto de impacto no dispositivo de lesão por percussão de fluido¹³.
2. Realize uma inspeção cuidadosa do dispositivo FPI para garantir que o pistão se mova suavemente dentro do cilindro e que os impactos possam ser conduzidos de forma eficaz (Figura 1B). Verifique se não há bolhas de ar presentes no sistema. Se forem detectadas bolhas de ar, adicione cuidadosamente água destilada ao sistema usando uma seringa de 50 mL e expulse as bolhas de ar empurrando rapidamente a haste do cilindro através de um conector de 3 vias próximo e/ou através da seringa.
   NOTA: O sistema FPI consiste em água destilada dentro do cilindro e tubulação conectada. É crucial calibrar o dispositivo antes da operação para garantir a precisão e a confiabilidade dos resultados.

3. Preparação de crânio afinado

NOTA: A cirurgia animal e a preparação do crânio afinado não devem ser realizadas em vista de outros camundongos. A janela do crânio afinado é útil para avaliar danos aos vasos cerebrais após um procedimento de FPI.

1. Cumpra os requisitos do centro de animais instruindo o operador experimental a usar um avental estéril e máscara durante todos os procedimentos de manuseio de animais.
2. Higienize a bancada do laboratório, o dispositivo FPI, a tubulação anestésica e o contraespaço adjacente antes de iniciar o experimento usando um spray de etanol a 70%.
3. Pese os camundongos nos grupos simulado e rmTBI antes da cirurgia e compare seus pesos com os registrados 1 semana antes do experimento. Exclua do estudo qualquer camundongo que apresente problemas de saúde, como casaco de pele áspero, diarréia, perda de peso ou letargia. Além disso, exclua camundongos que pesam menos de 20 g para garantir sua capacidade de tolerar impactos repetidos. Essas medidas são cruciais para manter o bem-estar animal e garantir resultados experimentais confiáveis.
4. Anestesiar camundongos com 4%-5% de isoflurano (em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 1 L/min) por 3-4 min em uma câmara de indução. Administre um lubrificante oftálmico (consulte a Tabela de Materiais) nos olhos do animal para manter a lubrificação durante toda a cirurgia. Para atenuar a dor, administre buprenorfina por via subcutânea (0,05 mg/kg) no ponto médio entre as orelhas 20 min antes da anestesia e, posteriormente, a cada 6 h por um período de 24 h. Além disso, no final da anestesia, administrar uma dose subcutânea única de 5 mg/kg de carprofeno a cada animal.
5. Desinfete a cabeça depois que o mouse perder os reflexos de endireitamento e retirada do pedal. Apare o pelo da cabeça do rato usando uma tesoura cirúrgica e use um barbeador para remover o pelo restante. Desinfete o couro cabeludo com três aplicações sequenciais de clorexidina a 2%, intercaladas com esfoliantes com etanol a 75%.
6. Coloque uma almofada cirúrgica estéril descartável sob o animal e a área circundante para garantir a higiene adequada. Faça uma incisão de 1,5 cm usando uma pequena tesoura cirúrgica fina ao longo da linha média do couro cabeludo do camundongo para expor totalmente o local da cirurgia (Figura 2A).
7. Prenda o mouse usando barras de ouvido não terminais em uma estrutura estereotáxica convencional (consulte a Tabela de Materiais). Ajuste a posição da cabeça do mouse em um quadro estereotáxico em um nível plano ou em um ângulo ligeiramente inclinado de acordo com a área de destino específica que será investigada. Limpe o pelo da área cirúrgica para evitar inflamação mais tarde.
8. Mantenha a temperatura corporal do mouse a 37 °C usando uma almofada de aquecimento isotérmica convencional (consulte a Tabela de Materiais).
9. Durante o processo de instalação do hub cirúrgico e de impacto (Luer Lock feminino), mantenha a anestesia do camundongo (sem resposta ao beliscão do dedo do pé ou da cauda) com um cone nasal que forneça uma concentração contínua de isoflurano de 2%, regulada por um vaporizador calibrado.
10. Limpe cuidadosamente a área cirúrgica ao redor da janela do crânio afinado usando um cotonete estéril embebido em solução salina.
11. Crie uma janela de crânio afinado, com aproximadamente 2,5 mm de diâmetro e 20 μm de espessura, no córtex motor frontal direito usando uma microbroca de ponta chata (ver Tabela de Materiais, Figura 2B) e uma lâmina microcirúrgica. Localize o local cirúrgico a 1,5 mm anterior ao bregma e 1,3-2,0 mm lateral à linha média (Figura 2C).
    1. Para evitar que a micro-broca penetre no crânio durante a criação da janela do crânio afinado, umedeça intermitentemente o crânio com solução salina enquanto tritura com a micro-broca.
    2. Confirme a espessura do crânio sondando suavemente o crânio afinado com a ponta achatada de uma agulha de seringa fina e avaliando sua maciez. Estime a clareza dos microvasos corticais expostos visualmente para determinar a espessura do crânio.
    3. Para verificar a espessura do crânio, aplique solução salina estéril na área diluída e inspecione visualmente usando um microscópio de dissecação convencional (consulte a Tabela de Materiais). Essa técnica pode ajudar a garantir que o crânio tenha sido adequadamente afinado.
       NOTA: Lubrifique o olho do rato durante toda a preparação do crânio afinado e o procedimento de modelagem rmTBI para evitar o ressecamento. O afinamento do crânio para menos de 15 μm acarreta o risco de trauma cortical leve, que pode resultar em inflamação cortical leve¹⁴.
12. Anexe uma Luer Lock fêmea ajustada (diâmetro interno de 2.2 mm, criada a partir de um cubo de agulha 19G, conforme mostrado na Figura 2D) ao local do crânio afinado. Prenda o Luer Lock com cola e cimento dentário (Figura 2E).
    NOTA: Ao usar cola para prender a trava Luer fêmea na área ao redor da janela do crânio afinado, é crucial secar completamente a área do crânio e evitar que o adesivo entre na própria janela. O adesivo dentro da janela pode reduzir significativamente a força de impacto do FPI.

4. Procedimento de modelagem rmTBI associado ao CHI

1. Introduzir rmTBI usando o método de percussão de fluido lateral com um dispositivo FPI modificado, conforme descrito anteriormente^13,15.
2. Depois de concluir os procedimentos da janela do crânio afinado e do cubo de impacto, transfira o mouse do aparelho estereotáxico para a plataforma do impactor.
3. Diante dos potenciais efeitos da anestesia sobre o tempo de reflexão de endireitamento do animal e a gravidade da lesão após percussão ^9,16, monitore a profundidade da anestesia avaliando os reflexos palpebral e de retirada da pata (Figura 2F).
4. Conecte o Luer Lock fêmea, que foi colado na janela do crânio afinado, ao Luer Lock macho na extremidade da tubulação do dispositivo FPI (Figura 2G).
   NOTA: Na modelagem rmTBI, a anestesia induzida por isoflurano em camundongos foi prolongada devido à indução de apneia e inconsciência por percussão.
5. Introduza dois TCE leve (intervalo de 48 h) com o dispositivo modificado. Aplique o primeiro impacto FPI imediatamente após concluir a cirurgia da janela do crânio afinado e instalar o Luer Lock. Administre o impacto do FPI apenas quando o camundongo mostrar o retorno de um reflexo de retirada a um beliscão da pata em cada ocasião (Figura 2H). A aplicação de um impacto FPI em camundongos profundamente anestesiados pode causar apneia prolongada e morte.
   1. Para aplicar o impacto FPI, levante o pêndulo até o grau designado ao longo do transferidor no dispositivo e solte o pêndulo usando o controle de software^13,15. O impacto deve atingir uma intensidade de percussão de 2,0 ± 0,1 atm, seguindo protocolos estabelecidos e utilizados em estudos com roedores 10,17,18. Exclua os animais de testes adicionais se o impacto não for registrado entre 1,9-2,1 atm ou se a fratura do crânio ocorreu durante o FPI.
   2. Para os ratos falsos, fixe-os no aparelho, mas não cause o impacto.
6. Após o impacto, desconecte imediatamente a conexão Luer Lock e transfira os mouses para uma almofada de aquecimento isotérmica para recuperação. Depois que o camundongo recuperar o estado de alerta e a consciência, devolva-o à sua gaiola de origem sem remover a trava Luer fêmea. Administre o segundo impacto FPI, da mesma maneira, 48 h depois.
7. Após o rmTBI, remova cuidadosamente a trava Luer fêmea e o cimento dentário. Suturar o couro cabeludo usando adesivo tecidual e usar uma pinça plana para beliscar o couro cabeludo para facilitar o processo adesivo (ver Tabela de Materiais; Figura 2I).
8. Para prevenir inflamação, infecção e aliviar a dor e o desconforto pós-cirúrgicos, aplique uma mistura de eritromicina e pomada de diclofenaco sódico na proporção de 1:1 (consulte a Tabela de Materiais) na ferida. Transfira os ratos para uma almofada de aquecimento isotérmica para recuperação.
9. Registre a duração do reflexo de endireitamento, que começa quando o mouse é removido do aparelho estereotáxico e colocado lateralmente na plataforma do impactor para FPI e continua até que o mouse possa ficar em pé independentemente.
10. Depois que o camundongo recuperar o estado de alerta e a consciência, devolva-o à sua gaiola de origem. Os camundongos geralmente estão totalmente conscientes e são capazes de andar dentro de 1,5 h após a lesão.
11. Nos dias seguintes à modelagem do TCE, observe os camundongos em busca de vários sinais, incluindo padrões respiratórios, presença de muco ao redor do nariz e da boca e vermelhidão, inchaço, exsudatos ou reabertura da área da ferida. Excluir animais do estudo com um ou mais dos sintomas anormais acima referidos.
    NOTA: A pré-microinjeção de AAV-GCaMP6s permite a observação da homeostase neuronal subjacente de Ca2+ e excitabilidade no córtex lesionado através da janela do crânio afinado usando microscopia de varredura a laser de dois fótons¹⁵.

5. Teste do labirinto aquático de Morris (MWM)

NOTA: O MWM (ver Tabela de Materiais) é um método amplamente reconhecido para avaliar o aprendizado espacial e os déficits de memória em camundongos após TCE.

1. Realize o teste MWM a partir de 7 dias após a lesão (DPI). A piscina circular do MWM tinha um diâmetro de 120 cm e uma altura de 50 cm, com a temperatura da água mantida em 25 °C. Separe a piscina circular em quatro quadrantes, com a plataforma de fuga, uma plataforma redonda com diâmetro de 6 cm e altura de 30 cm, submersa 1 cm abaixo da superfície da água no quadrante nordeste.
2. Posicione uma câmera diretamente acima da piscina circular para registrar a trajetória de movimento dos ratos. Marque os mouses com fita preta nas costas para facilitar o reconhecimento pelo software de aquisição de imagem e para gravação de dados, incluindo latência, distância de natação e trajetória de movimento.
3. Coloque os ratos na água, de frente para a parede interna de cada um dos quatro quadrantes, uma vez para cada quadrante. Assim que os ratos encontrarem a plataforma, deixe-os descansar lá por 10 s. Se um mouse não conseguir encontrar a plataforma dentro de 60 s, peça ao operador para guiar o mouse até a plataforma, deixe-o descansar na plataforma por 10 s e, em seguida, devolva o mouse à sua gaiola inicial para descansar.
4. Repita para cada camundongo o teste de aquisição 4x ao dia. Após os testes de aquisição, em 12 DPI, conduza um experimento de sonda espacial de 60 s e registre o número de vezes que os camundongos cruzaram a área da plataforma original e a duração da permanência do camundongo no quadrante onde a plataforma estava localizada.
5. Após cada tentativa, seque rapidamente os camundongos com uma toalha ou coloque sob uma lâmpada de aquecimento para manter a temperatura corporal e evitar a hipotermia durante a tentativa de aquisição de 60 s de DPI 7 a DPI 11.
6. Após a conclusão dos procedimentos experimentais descritos acima, anestesiar os camundongos com pentobarbital (45 mg / kg, i.p.) a 13 DPI. Perfundir solução salina isotônica por via transcárdica, seguida de perfusão com paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,2). Recupere os cérebros para coloração HE convencional para avaliar alterações macroscópicas da morfologia cortical e do hipocampo. Uma descrição detalhada do protocolo de coloração HE pode ser encontrada em publicações anteriores^13,15.
7. Após a conclusão de todos os experimentos, eutanasiar camundongo por injeção de overdose de pentobarbital (≥100 mg / kg, ip) se não houver amostras de camundongo necessárias. Antes de colher tecidos ou descartar a carcaça, monitore o camundongo até que não haja batimentos cardíacos por pelo menos 60 s.

Resultados

O protocolo descrito neste estudo descreve um método para induzir rmTBI através de uma janela de crânio afinada, que oferece uma solução para a lesão cerebral causada pela preparação da craniotomia durante a modelagem convencional de TCE de percussão. Ao utilizar este procedimento de percussão de fluido modificado com o dispositivo modificado, foi alcançada maior precisão e reprodutibilidade do impacto do FPI¹³. O impactor modificado tem a versatilidade de ser usado para modelagem CHI ...

Discussão

O TCE refere-se a dois tipos primários, fechado e penetrante, sendo o último caracterizado por uma ruptura do crânio e da dura-máter. Dados clínicos sugerem que as CHIs são mais prevalentes do que as lesões penetrantes ^1,2. Após um único TCE leve, a maioria dos pacientes apresenta sintomas de SCP que geralmente se resolvem em um curto período de tempo, e há controvérsia quanto à proporção de pacientes cujos PCS evoluem para sequelas de longo prazo<...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% ethanol	Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.	220502
Buprenorphine hydrochloride	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd	H12020272	Solution, Analgesic
Carprofen	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Powder, Analgesic
Chlorhexidine digluconate	Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.	18472-51-0	19%-21% aqueous solution, Antimicrobial
Dental cement and solvent kit	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3#	Powder reconsituted in matching solvent
Dissecting microscope	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Erythromycin ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	220412	Antibiotic
Fiber Optic Cold Light Source	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
Flat-tipped micro-drill bit	Shenzhen RWD Life Science Inc.	HM31008	2 mm, steel
FPI device software	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR mice	Jinhua Laboratory Animal Center	Stock#2023091	25 Male mice, 25-30g, 8 weeks old
Isoflurane	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.	2023090501
Isothermal heating pad	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Custom made using a 19G needle hub
Micro hand-held skull drill	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38,000rpm
Modified FPI device	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris water maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63031	Evaluate mouse spatial learning and memory abilities
Open field	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Evaluate mouse locomoation and anxiety
Ophthalmic lubricant	Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.	SC230724B
Sodium diclofenac ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	221207	nonsteroidal anti-inflammatory drug
Small animal anesthesia system-Enhanced	Shenzhen RWD Life Science Inc.	R530IP
Smart video-tracking system	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	Animal tracking and analysis
Stereotactic frame	Shenzhen RWD Life Science Inc.	68043
Vetbond Tissue Adhesive	3M, St Paul, MN, USA	202402AX	Suture the animal wound
Y maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Evaluate mouse spatial working memory