얇아진 두개골 창과 유체 타악기를 통합한 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상의 수정된 마우스 모델

요약

이 프로토콜은 폐쇄성 두부 손상(CHI) 방법을 통해 유도된 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상(rmTBI)의 수정된 마우스 모델을 제시합니다. 이 접근법은 두개골 창과 유체 타악기를 사용하여 수막 노출로 인해 일반적으로 발생하는 염증을 줄이고 설치류의 rmTBI 모델링에서 재현성 및 정확도를 향상시킵니다.

초록

경미한 외상성 뇌 손상은 임상적으로 매우 이질적인 신경 장애입니다. 경증 TBI 후 신경병리학의 기전을 연구하고 치료제를 테스트하기 위해 잘 정의된 병리학을 가진 재현성이 높은 외상성 뇌손상(TBI) 동물 모델이 시급히 필요합니다. 동물 모델에서 TBI의 전체 후유증을 복제하는 것은 어려운 일임이 입증되었습니다. 따라서 TBI 환자에서 볼 수 있는 다양한 측면과 중증도를 설명하기 위해 TBI의 여러 동물 모델을 사용할 수 있어야 합니다. CHI는 rmTBI의 설치류 모델을 제작하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 그러나 이 방법은 사용된 충격 방법, 두개골 뼈의 두께와 모양, 동물 무호흡증, 사용된 머리 지지대 및 고정 유형 등 여러 요인에 취약합니다. 이 프로토콜의 목적은 얇은 두개골 창과 FPI(Fluid Percussion Injury) 방법의 조합을 시연하여 CHI 관련 rmTBI의 정확한 마우스 모델을 생성하는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 두개골 두께, 모양 및 머리 지지대를 포함하여 CHI 및 FPI 모델링의 정확성과 일관성에 영향을 줄 수 있는 요인을 최소화하는 것입니다. 얇은 두개골 창 방법을 활용함으로써 개두술 및 FPI로 인한 잠재적 염증을 최소화하여 경증 TBI 환자에서 관찰된 임상적 특징을 복제하는 개선된 마우스 모델을 얻을 수 있습니다. 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin, HE) 염색을 사용한 행동 및 조직학적 분석 결과는 rmTBI가 뇌의 행동과 총체적 형태 모두에 변화를 일으키는 누적 손상으로 이어질 수 있음을 시사합니다. 전반적으로, 변형된 CHI 관련 rmTBI는 연구자들이 rmTBI의 초점 및 미만성 병태생리학적 변화에 기여하는 기본 메커니즘을 탐구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서문

뇌진탕 및 준뇌진탕을 포함한 경증 TBI는 모든 TBI 사례의 대부분을 차지합니다(전체 TBI의 >80%)¹. 경증 TBI는 일반적으로 낙상, 교통사고, 폭력 행위, 접촉 스포츠(예: 축구, 복싱, 하키) 및 군사 전투에 의해 발생한다 ^2,3. 경증 TBI는 환자의 일생 동안 신경 행동 기능에 영향을 미치고 신경 퇴행성 질환의 위험을 증가시키는 신경 생물학적 사건으로 이어질 수 있습니다 ^4,5,6. 동물 모델은 경증 TBI를 연구할 수 있는 효율적이고 통제된 수단을 제공하며, 경증 TBI의 진단 및 치료를 더욱 향상시킬 수 있기를 희망합니다. 경증 TBI에 대한 다양한 모델이 개발되었는데, 예를 들어 CCI(Controlled Cortical Impact), WD(Weight Drop), FPI(Fluid Percussion Injury) 및 blast-TBI 모델 ^7,8이 있....

프로토콜

이 프로토콜과 관련된 모든 절차는 기관 동물 보호 및 사용 위원회 승인(Zhejiang Normal University, 허가 번호, dw2019005)에 따라 수행되었으며 ARRIVE 및 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 수행되었습니다. 기술 사양은 재료 표에서 확인할 수 있습니다.

1. 동물 취급 절차

1. 22-24 °C의 온도, 40%-60%의 습도 범위, 12시간의 명암주기가 있는 통제된 환경에서 생쥐를 사육하고 물과 표준 생쥐 차우에 대한 임시 접근을 제공합니다. 이 실험의 목적을 위해, 25마리의 ICR 수컷 마우스(25-30 g, 8주령)를 사용하였다.
2. 마우스를 대조군(n=12) 또는 rmTBI 그룹(n=13)에 무작위로 할당합니다. rmTBI를 겪은 쥐에 대한 가짜 쥐의 잠재적인 공격을 방지하려면 별도의 케이지에 분리하십시오.
3. 실험을 시작하기 전에 쥐가 케이지 환경에 적응할 수 있도록 최소 1주일을 주십시오. 이 적응 기간은 쥐가 주변 환경에 익숙해지도록 하고 연구 중 생리적 또는 행동 반응에 대한 스트레스나 불안의 잠재적 영향을 최소화....

결과

이 연구에서 설명된 프로토콜은 얇은 두개골 창을 통해 rmTBI를 유도하는 방법을 간략하게 설명하며, 이는 기존 타악기 TBI 모델링 중 개두술 준비로 인한 뇌 손상에 대한 솔루션을 제공합니다. 이 수정된 유체 타악기 절차를 수정된 장치와 함께 사용함으로써 FPI 충격의 향상된 정밀도와 재현성이 달성되었습니다¹³. 수정된 임팩터는 두개골 개두술의 유무에 관계없이 CHI 및 FPI 모델.......

토론

TBI는 폐쇄형과 관통성의 두 가지 주요 유형을 말하며, 후자는 두개골과 경막의 파괴를 특징으로 합니다. 임상 데이터에 따르면 CHI는 관통 부상보다 더 흔합니다 ^1,2. 한 번의 경미한 TBI 후유증 후, 대부분의 환자는 일반적으로 단기간에 해결되는 PCS 증상을 경험하며, PCS가 장기 후유증으로 발전하는 환자의 비율에 대해서는 논란이 있다^{23,24<.......}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% ethanol	Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.	220502
Buprenorphine hydrochloride	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd	H12020272	Solution, Analgesic
Carprofen	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Powder, Analgesic
Chlorhexidine digluconate	Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.	18472-51-0	19%-21% aqueous solution, Antimicrobial
Dental cement and solvent kit	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3#	Powder reconsituted in matching solvent
Dissecting microscope	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Erythromycin ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	220412	Antibiotic
Fiber Optic Cold Light Source	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
Flat-tipped micro-drill bit	Shenzhen RWD Life Science Inc.	HM31008	2 mm, steel
FPI device software	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR mice	Jinhua Laboratory Animal Center	Stock#2023091	25 Male mice, 25-30g, 8 weeks old
Isoflurane	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.	2023090501
Isothermal heating pad	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Custom made using a 19G needle hub
Micro hand-held skull drill	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38,000rpm
Modified FPI device	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris water maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63031	Evaluate mouse spatial learning and memory abilities
Open field	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Evaluate mouse locomoation and anxiety
Ophthalmic lubricant	Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.	SC230724B
Sodium diclofenac ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	221207	nonsteroidal anti-inflammatory drug
Small animal anesthesia system-Enhanced	Shenzhen RWD Life Science Inc.	R530IP
Smart video-tracking system	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	Animal tracking and analysis
Stereotactic frame	Shenzhen RWD Life Science Inc.	68043
Vetbond Tissue Adhesive	3M, St Paul, MN, USA	202402AX	Suture the animal wound
Y maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Evaluate mouse spatial working memory