İnceltilmiş kafatası penceresi ve sıvı perküsyonu içeren tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarının modifiye edilmiş fare modeli

Özet

Bu protokol, kapalı kafa travması (CHI) yöntemiyle indüklenen tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarının (rmTBI) modifiye edilmiş bir fare modelini sunar. Yaklaşım, meninkslere maruz kalmanın yaygın olarak neden olduğu iltihabı azaltmak için inceltilmiş bir kafatası penceresi ve sıvı perküsyonunun yanı sıra kemirgenlerde rmTBI modellemesinde gelişmiş tekrarlanabilirlik ve doğruluk içerir.

Özet

Hafif travmatik beyin hasarı klinik olarak oldukça heterojen bir nörolojik bozukluktur. Hafif TBH sonrası nöropatoloji mekanizmalarını incelemek ve terapötikleri test etmek için iyi tanımlanmış patolojilere sahip yüksek oranda tekrarlanabilir travmatik beyin hasarı (TBH) hayvan modellerine acilen ihtiyaç vardır. TBH'nin tüm sekellerini hayvan modellerinde çoğaltmanın zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, TBH hastalarında görülen çeşitli yönleri ve ciddiyetleri hesaba katmak için TBH'nin birden fazla hayvan modelinin mevcudiyeti gereklidir. CHI, rmTBI'nin kemirgen modellerini üretmek için en yaygın yöntemlerden biridir. Bununla birlikte, bu yöntem, kullanılan darbe yöntemi, kafatası kemiğinin kalınlığı ve şekli, hayvan apnesi ve kullanılan kafa desteği ve immobilizasyon türü dahil olmak üzere birçok faktöre karşı hassastır. Bu protokolün amacı, CHI ile ilişkili rmTBI'nin kesin bir fare modelini üretmek için inceltilmiş kafatası penceresi ve sıvı perküsyon yaralanması (FPI) yöntemlerinin bir kombinasyonunu göstermektir. Bu protokolün birincil amacı, kafatası kemiği kalınlığı, şekli ve kafa desteği dahil olmak üzere CHI ve FPI modellemesinin doğruluğunu ve tutarlılığını etkileyebilecek faktörleri en aza indirmektir. İnceltilmiş bir kafatası penceresi yöntemi kullanılarak, kraniyotomi ve FPI'ye bağlı potansiyel iltihaplanma en aza indirilir ve hafif TBH'li hastalarda gözlenen klinik özellikleri kopyalayan gelişmiş bir fare modeli elde edilir. Hematoksilen ve eozin (HE) boyama kullanılarak yapılan davranış ve histolojik analizden elde edilen sonuçlar, rmTBI'nin beynin hem davranışında hem de brüt morfolojisinde değişiklikler üreten kümülatif bir yaralanmaya yol açabileceğini düşündürmektedir. Genel olarak, modifiye edilmiş CHI ile ilişkili rmTBI, araştırmacıların rmTBI'daki fokal ve diffüz patofizyolojik değişikliklere katkıda bulunan altta yatan mekanizmaları keşfetmeleri için yararlı bir araç sunar.

Giriş

Beyin sarsıntısı ve alt beyin sarsıntısı dahil olmak üzere hafif TBH, tüm TBH vakalarının çoğunluğunu oluşturur (tüm TBH'lerin %>80'i)¹. Hafif TBH genellikle düşmelerden, trafik kazalarından, şiddet eylemlerinden, temas sporlarından (örneğin, futbol, boks, hokey) ve askeri mücadeleden kaynaklanır ^2,3. Hafif TBH, hastanın yaşamı boyunca nörodavranışsal işlevleri etkileyen ve nörodejeneratif hastalık riskini artıran nörobiyolojik olaylara yol açabilir ^4,5,6. Hayvan modelleri, hafif TBH'nin tanı ve tedavisini daha da geliştirme umuduyla hafif TBH'yi incelemek için verimli ve kontrollü bir yol sağlar. Hafif TBI için kontrollü kortikal etki (CCI), ağırlık düşüşü (WD), sıvı perküsyon yaralanması (FPI) ve blast-TBI modelleri ^7,8 gibi çeşitli modeller geliştirilmiştir. Tek bir deneysel model, TBH'nin neden olduğu patolojinin tüm karmaşıklığını taklit edemez ^9,10. Bu modellerin heterojenliği, hafif TBH hastaları ile ilişkili çeşitli özellikleri ele almak ve karşılık gelen hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için avantajlıdır. Bununla birlikte, TBH'nin her bir hayvan modelinin, hafif hayvan TBH'si ve bunların klinik önemi ile ilgili mevcut bilgilerimizi sınırlayan sınırlamaları³ vardır.

WD ve CCI modelleri, serebral doku kaybı, akut subdural hematom, aksonal yaralanma, beyin sarsıntısı, kan-beyin bariyeri disfonksiyonu ve hatta TBI ^3,11,12'yi takiben koma gibi klinik durumları çoğaltmak için kullanılır. WD modeli, dura mater veya kafatasına serbestçe düşen ağırlıklarla vurarak beyin hasarına neden olmayı içerir. Ağırlıklı bir nesnenin sağlam bir kafatası üzerindeki etkisi, karışık odak/yaygın yaralanmaları çoğaltabilir; Bununla birlikte, bu yöntem, yaralanma bölgesinin zayıf doğruluğu ve tekrarlanabilirliği, geri tepme yaralanması ve kafatası kırıklarına bağlı daha yüksek mortalite oranı ile ilişkilidir ^3,11,12. CCI modeli, açıkta kalan dura materini doğrudan etkilemek için hava tahrikli metal uygulanmasını içerir. WD modeliyle karşılaştırıldığında, CCI modeli daha doğru ve tekrarlanabilirdir, ancak çarpma ucunun¹¹ küçük çapı nedeniyle yaygın yaralanmaya neden olmaz. FPI modellemesi sırasında, beyin dokusu perküsyon ile kısa bir süre yer değiştirir ve deforme olur. FPI, karışık fokal / diffüz yaralanmaya neden olabilir ve TBH'den sonra intrakraniyal kanama, beyin şişmesi ve ilerleyici gri madde hasarını çoğaltabilir. Bununla birlikte, FPI, beyin sapı hasarı ve uzamış apne nedeniyle yüksek bir mortalite oranına sahiptir ^3,12. Konvansiyonel WD, CCI ve FPI modellerinde yer alan kraniyotomi, kortikal kontüzyon, hemorajik lezyonlar, kan-beyin bariyerinin hasarı, immün hücre infiltrasyonu, glial hücre aktivasyonu, uzamış modelleme süresi ve olası ölümcül sonuçlara yol açabilir ^3,12.

Hafif TBH, 13 ila 15² aralığında bir GCS (Glasgow koma ölçeği, GCS) skoru ile karakterizedir. Hafif TBH fokal veya yaygın olabilir ve hücresel homeostazın bozulması, eksitotoksisite, glikoz tükenmesi, mitokondriyal disfonksiyon, kan akışı bozukluğu ve aksonal hasar gibi akut yaralanmaların yanı sıra aksonal hasar, nöroinflamasyon ve gliozis dahil olmak üzere subakut yaralanmalarla ilişkilidir ^2,3. TBH'nin karmaşık patofizyolojisini tanımlamada önemli ilerlemeye rağmen, hafif TBH / rmTBH'nin altta yatan mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır ve daha fazla araştırma gerektirmektedir⁹. CHI'nin en yaygın TBI¹² türü olduğu göz önüne alındığında, bu protokol, inceltilmiş bir kafatası penceresinde¹³ etki gerçekleştirmek için modifiye edilmiş bir FPI cihazı kullanarak rmTBI'nin daha hassas bir şekilde kontrol edilen bir fare modeli oluşturmak için yeni bir yaklaşım sunar. Bu yaklaşım, kraniyotomi kaynaklı yaralanmalardan, değişken kafatası kalınlığından ve şekil kaynaklı yanlışlıklardan ve geri tepme yaralanmalarından kaçınarak, WD, CCI ve FPI modelleriyle ilişkili ana dezavantajların üstesinden gelmeyi amaçlamaktadır. İnceltilmiş kafatası penceresine FPI etkisi uygulamak, rmTBI'yi takiben serebral damar hasarını değerlendirmek için uygundur ve bazı modellerde yüksek mortalite oranlarını en aza indirmeye yardımcı olur, bu da TBH hastalarının klinik özelliklerine daha yakın bir benzerlik sağlar.

Protokol

Bu protokolde yer alan tüm prosedürler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onayı (Zhejiang Normal Üniversitesi, İzin Numarası, dw2019005) ve ARRIVE ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Teknik özellikler Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. Hayvan taşıma prosedürü

1. 22-24 °C sıcaklık, %40-%60 arasında değişen nem, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü ile kontrollü bir ortamda fareleri barındırır ve suya ve standart fare yemeğine ad libitum erişim sağlar. Bu deneyin amacı için, 25 ICR erkek faresi (25-30 g, 8 haftalık) kullanıldı.
2. Fareleri rastgele olarak kontrol grubuna (n = 12) veya rmTBI grubuna (n = 13) tahsis edin. Sahte farelerin rmTBI uygulanan farelere karşı olası saldırganlığını önlemek için, onları farklı kafeslere ayırın.
3. Deneye başlamadan önce farelere kafes ortamlarına alışmaları için en az 1 hafta süre verin. Bu alışma dönemi, farelerin çevrelerine aşina olmalarını sağlar ve çalışma sırasında stres veya kaygının fizyolojik veya davranışsal tepkiler üzerindeki potansiyel etkilerini en aza indirir.

2. TBI cihazının hazırlanması

1. Değiştirilmiş bir FPI cihazı kullanarak farelerde rmTBI modelini üretin (bkz. Şekil 1A) ¹³. FPI cihazını kullanmadan önce, silindir ile boru arasındaki ve üç konektör ile boru arasındaki bağlantılara özellikle dikkat ederek tüm bağlantılarda sızıntı veya çatlama belirtileri olup olmadığını dikkatlice inceleyin. Darbe basınçlarını doğru bir şekilde belirlemek için, sıvı perküsyon yaralanma cihazı¹³ üzerindeki çarpma noktasına bir basınç dönüştürücü monte edildi.
2. Pistonun silindir içinde düzgün bir şekilde hareket ettiğinden ve darbelerin etkili bir şekilde gerçekleştirilebildiğinden emin olmak için FPI cihazını dikkatli bir şekilde inceleyin (Şekil 1B). Sistemde hava kabarcığı olmadığını doğrulayın. Hava kabarcıkları tespit edilirse, 50 mL'lik bir şırınga kullanarak sisteme dikkatlice damıtılmış su ekleyin ve silindir çubuğunu yakındaki 3 bir konektörden ve/veya şırıngadan hızlı bir şekilde iterek hava kabarcıklarını dışarı atın.
   NOT: FPI sistemi, silindir ve bağlı boru içindeki damıtılmış sudan oluşur. Sonuçların doğruluğunu ve güvenilirliğini sağlamak için çalıştırmadan önce cihazı kalibre etmek çok önemlidir.

3. İnceltilmiş kafatası hazırlığı

NOT: Hayvan cerrahisi ve inceltilmiş kafatası hazırlığı, diğer fareler göz önünde bulundurularak yapılmamalıdır. İnceltilmiş kafatası penceresi, bir FPI prosedürünü takiben serebral damar hasarını değerlendirmek için kullanışlıdır.

1. Deney operatörüne tüm hayvan taşıma prosedürleri sırasında steril bir önlük ve maske takması talimatını vererek hayvan merkezinin gereksinimlerine uyun.
2. %70 etanol sprey kullanarak deneye başlamadan önce laboratuvar tezgahını, FPI cihazını, anestezik boruyu ve bitişik tezgah boşluğunu sterilize edin.
3. Ameliyattan önce hem sahte hem de rmTBI gruplarındaki fareleri tartın ve ağırlıklarını deneyden 1 hafta önce kaydedilenlerle karşılaştırın. Kaba kürk manto, ishal, kilo kaybı veya uyuşukluk gibi kötü sağlık sergileyen herhangi bir fareyi çalışmadan çıkarın. Ek olarak, tekrarlanan darbelere tahammül edebilmelerini sağlamak için 20 g'dan daha hafif olan fareleri hariç tutun. Bu önlemler, hayvan refahının korunmasında ve güvenilir deneysel sonuçların sağlanmasında çok önemlidir.
4. Fareleri bir indüksiyon odasında 3-4 dakika boyunca% 4 -% 5 izofluran (1 L / dak akış hızında% 100 oksijende) ile uyuşturun. Ameliyat boyunca yağlamayı sürdürmek için hayvanın gözlerine oftalmik bir kayganlaştırıcı ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın. Ağrıyı hafifletmek için, anesteziden 20 dakika önce kulakları arasındaki orta noktada ve daha sonra her 6 saatte bir 24 saat boyunca deri altından (0.05 mg / kg) buprenorfin uygulayın. Ayrıca, anestezinin sonunda, her hayvana tek bir deri altı 5 mg / kg karprofen dozu uygulayın.
5. Fare sağ ve pedal çekme reflekslerini kaybettikten sonra kafayı dezenfekte edin. Cerrahi makas kullanarak farenin kafasındaki kürkü kesin ve kalan kürkü çıkarmak için bir tıraş makinesi kullanın. Saç derisini,% 75 etanol fırçaları ile serpiştirilmiş% 2 klorheksidin üç ardışık uygulama ile dezenfekte edin.
6. Uygun hijyeni sağlamak için hayvanın ve çevresinin altına tek kullanımlık steril bir cerrahi ped yerleştirin. Cerrahi bölgeyi tamamen ortaya çıkarmak için farenin kafa derisinin orta hattı boyunca ince küçük bir cerrahi makas kullanarak 1,5 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 2A).
7. Geleneksel bir stereotaksik çerçevede terminal olmayan kulak çubukları kullanarak fareyi sabitleyin (bkz. Fare kafasının konumunu, araştırılacak belirli hedef alana göre stereotaksik bir çerçevede düz bir seviyede veya hafif eğimli bir açıda ayarlayın. Daha sonra iltihaplanmayı önlemek için cerrahi bölgedeki kürkü temizleyin.
8. Geleneksel bir izotermal ısıtma yastığı kullanarak farenin vücut sıcaklığını 37 °C'de tutun (bkz. Malzeme Tablosu).
9. Cerrahi ve darbe göbeği (dişi Luer Kilidi) kurulum işlemi sırasında, kalibre edilmiş bir buharlaştırıcı tarafından düzenlenen sürekli% 2'lik bir izofluran konsantrasyonu sağlayan bir burun konisi ile fare anestezisini (ayak parmağı veya kuyruk sıkışmasına yanıt vermeden) koruyun.
10. İnceltilmiş kafatası penceresinin etrafındaki cerrahi alanı, tuzlu suyla ıslatılmış steril bir pamuklu çubuk kullanarak dikkatlice temizleyin.
11. Düz uçlu bir mikro matkap ucu (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 2B) ve bir mikrocerrahi bıçak kullanarak sağ frontal motor kortekste yaklaşık 2,5 mm çapında ve 20 μm kalınlığında inceltilmiş bir kafatası penceresi oluşturun. Cerrahi bölgeyi bregmanın 1.5 mm önünde ve orta hattın 1.3-2.0 mm yanında konumlandırın (Şekil 2C).
    1. İnceltilmiş kafatası penceresinin oluşturulması sırasında mikro matkabın kafatasına nüfuz etmesini önlemek için, mikro matkapla taşlama yaparken kafatasını aralıklı olarak tuzlu su ile nemlendirin.
    2. İnceltilmiş kafatasını ince bir şırınga iğnesinin düzleştirilmiş ucuyla nazikçe incelterek ve yumuşaklığını değerlendirerek kafatasının kalınlığını onaylayın. Kafatasının kalınlığını belirlemek için maruz kalan kortikal mikro damarların netliğini görsel olarak tahmin edin.
    3. Kafatasının kalınlığını doğrulamak için, inceltilmiş alana steril salin uygulayın ve geleneksel bir diseksiyon mikroskobu kullanarak görsel olarak inceleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Bu teknik, kafatasının yeterince inceltildiğinden emin olmaya yardımcı olabilir.
       NOT: Kurumayı önlemek için tüm inceltilmiş kafatası hazırlığı ve rmTBI modelleme prosedürü boyunca fare gözünü yağlayın. Kafatasının 15 μm'den daha az inceltilmesi, hafif kortikal travma riski taşır ve bu da hafif kortikal iltihaplanma ile sonuçlanabilir¹⁴.
12. İnceltilmiş kafatası bölgesine ayarlanmış bir dişi Luer Kilidi ( Şekil 2.2D'de gösterildiği gibi 19G iğne göbeğinden oluşturulan 2 mm iç çap) takın. Luer Lock'u tutkal ve diş çimentosu ile sabitleyin (Şekil 2E).
    NOT: Dişi Luer kilidini inceltilmiş kafatası penceresinin etrafındaki alana sabitlemek için yapıştırıcı kullanırken, kafatası bölgesini iyice kurutmak ve yapıştırıcının pencerenin kendisine girmesini önlemek çok önemlidir. Pencere içindeki yapıştırıcı, FPI'nin darbe kuvvetini önemli ölçüde azaltabilir.

4. CHI ile ilişkili rmTBI modelleme prosedürü

1. Daha önce açıklandığı gibi modifiye edilmiş bir FPI cihazı ile yanal sıvı perküsyon yöntemini kullanarak rmTBI'yi tanıtın^13,15.
2. İnceltilmiş kafatası penceresi ve darbe göbeği prosedürlerini tamamladıktan sonra, fareyi stereotaksik cihazdan çarpma tertibatı platformuna aktarın.
3. Anestezinin perküsyon sonrası hayvan düzeltme refleks süresi ve yaralanma şiddeti üzerindeki potansiyel etkileri göz önüne alındığında ^9,16, palpebral ve pençe çekilme reflekslerini değerlendirerek anestezi derinliğini izleyin (Şekil 2F).
4. İnceltilmiş kafatası penceresine yapıştırılan dişi Luer Kilidini, FPI cihaz hortumunun ucundaki erkek Luer Kilidine bağlayın (Şekil 2G).
   NOT: rmTBI modellemesinde, farelerde izofluran ile indüklenen anestezi, apne indüksiyonu ve perküsyon ile bilinç kaybı nedeniyle uzatıldı.
5. Modifiye edilmiş cihazla iki hafif TBI (48 saat aralıkla) tanıtın. İnceltilmiş kafatası pencere ameliyatını tamamladıktan ve Luer Lock'u taktıktan hemen sonra ilk FPI etkisini uygulayın. FPI etkisini yalnızca fare her seferinde bir pençe tutamına geri çekilme refleksinin geri döndüğünü gösterdiğinde uygulayın (Şekil 2H). Derin anestezi uygulanmış farelerde FPI etkisi uygulamak, uzun süreli apne ve ölüme neden olabilir.
   1. FPI etkisini uygulamak için, sarkacı cihaz üzerindeki iletki boyunca belirtilen dereceye kadar kaldırın ve yazılım kontrolünü^13,15 kullanarak sarkacı serbest bırakın. Etki, kemirgen çalışmalarında kullanılan yerleşik protokolleri izleyerek 2.0 ± 0.1 atm'lik bir perküsyon yoğunluğuna ulaşmalıdır 10,17,18. Etki 1.9-2.1 atm arasında kaydedilmediyse veya FPI sırasında kafatası kırığı meydana geldiyse hayvanları daha ileri testlerden hariç tutun.
   2. Sahte fareler için, bunları cihaza sabitleyin, ancak darbeyi vermeyin.
6. Çarpmanın ardından, Luer Lock bağlantısını hemen ayırın ve fareleri geri kazanım için izotermal bir ısıtma yastığına aktarın. Fare uyanıklığını ve bilincini geri kazandıktan sonra, dişi Luer kilidini çıkarmadan onu ev kafesine geri koyun. İkinci FPI etkisini aynı şekilde 48 saat sonra uygulayın.
7. RmTBI'dan sonra dişi Luer kilidini ve diş çimentosunu dikkatlice çıkarın. Doku yapıştırıcısı kullanarak kafa derisini dikin ve yapıştırma işlemini kolaylaştırmak için kafa derisini sıkıştırmak için düz forseps kullanın (bkz . Şekil 2I).
8. Enflamasyonu, enfeksiyonu önlemek ve ameliyat sonrası ağrı ve rahatsızlığı hafifletmek için, yaraya 1: 1 oranında eritromisin ve sodyum diklofenak merhem karışımı uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Fareleri geri kazanım için izotermal bir ısıtma yastığına aktarın.
9. Fare stereotaksik aparattan çıkarıldığında ve FPI için çarpma platformuna yanal olarak yerleştirildiğinde başlayan ve fare bağımsız olarak dik durabilene kadar devam eden doğrultma refleksinin süresini kaydedin.
10. Fare uyanıklığını ve bilincini geri kazandıktan sonra, onu ev kafesine geri koyun. Fareler tipik olarak tamamen bilinçlidir ve yaralanmadan sonraki 1,5 saat içinde yürüyebilirler.
11. TBI modellemesini takip eden günlerde, fareleri solunum paternleri, burun ve ağız çevresinde mukus varlığı ve kızarıklık, şişme, eksüdalar veya yara bölgesinin yeniden açılması gibi çeşitli belirtiler açısından gözlemleyin. Yukarıdaki anormal semptomlardan bir veya daha fazlasına sahip hayvanları çalışmadan çıkarın.
    NOT: AAV-GCaMP6'ların ön mikroenjeksiyonu, iki fotonlu lazer tarama mikroskobu¹⁵ kullanılarak inceltilmiş kafatası penceresinden yaralı kortekste altta yatan nöronal Ca2+ homeostazının ve uyarılabilirliğin gözlemlenmesine izin verir.

5. Morris su labirenti (MWM) testi

NOT: MWM ( Materyal Tablosuna bakınız), TBH'yi takiben farelerde uzamsal öğrenme ve hafıza eksikliklerini değerlendirmek için yaygın olarak tanınan bir yöntemdir.

1. MWM testini yaralanmadan 7 gün sonra (DPI) başlayarak yapın. MWM'nin dairesel havuzu 120 cm çapında ve 50 cm yüksekliğindeydi ve su sıcaklığı 25 °C'de tutuldu. Dairesel havuzu, kuzeydoğu çeyreğinde su yüzeyinin 1 cm altına batırılmış, 6 cm çapında ve 30 cm yüksekliğinde yuvarlak bir platform olan kaçış platformu ile dört çeyreğe ayırın.
2. Farelerin hareket yörüngesini kaydetmek için bir kamerayı doğrudan dairesel havuzun üzerine yerleştirin. Görüntü alma yazılımı tarafından tanınmayı kolaylaştırmak ve gecikme, yüzme mesafesi ve hareket yörüngesi dahil olmak üzere veri kaydı için fareleri sırtlarında siyah bantla işaretleyin.
3. Fareleri, her kadran için bir kez olmak üzere, dört kadranın her birinin iç duvarına bakacak şekilde suya yerleştirin. Fareler platformu bulduktan sonra 10 saniye orada dinlenmelerine izin verin. Bir fare platformu 60 saniye içinde bulamazsa, operatörden fareyi platforma yönlendirmesini, 10 saniye boyunca platformda dinlenmesine izin vermesini ve ardından fareyi dinlenmek için ev kafesine geri koymasını isteyin.
4. Her fare için edinme denemesini günde 4 kez tekrarlayın. Edinme denemelerinin ardından, 12 DPI'da, 60 s'lik bir uzamsal prob deneyi yapın ve farelerin orijinal platform alanını kaç kez geçtiğini ve farenin platformun bulunduğu kadranda kalma süresini kaydedin.
5. Her denemeden sonra, DPI 7'den DPI 11'e kadar 60 s edinme denemesi sırasında vücut sıcaklıklarını korumak ve hipotermiyi önlemek için fareleri bir havluyla hızlı bir şekilde kurulayın veya bir ısıtma lambasının altına yerleştirin.
6. Yukarıda özetlenen deneysel prosedürlerin tamamlanmasından sonra, fareleri 13 DPI'da pentobarbital (45 mg / kg, ip) ile uyuşturun. İzotonik salini transkardiyal olarak perfüze edin, ardından fosfat tamponlu salin (pH 7.2) içinde% 4 paraformaldehit ile perfüzyon yapın. Brüt kortikal ve hipokampal morfoloji değişikliklerini değerlendirmek için geleneksel HE boyama için beyinleri alın. HE boyama protokolünün ayrıntılı bir açıklaması önceki yayınlarda^{bulunabilir 13,15}.
7. Tüm deneyler tamamlandıktan sonra, fare örneği gerekmiyorsa, aşırı dozda pentobarbital (≥100 mg / kg, i.p.) enjeksiyonu ile fareye ötenazi yapın. Mendilleri toplamadan veya karkası atmadan önce, fareyi en az 60 saniye boyunca kalp atışı olmayana kadar izleyin.

Sonuçlar

Bu çalışmada açıklanan protokol, konvansiyonel perküsyon TBI modellemesi sırasında kraniyotomi hazırlığının neden olduğu beyin hasarına bir çözüm sunan, inceltilmiş bir kafatası penceresinden rmTBI'yi indüklemek için bir yöntemi özetlemektedir. Bu modifiye edilmiş sıvı perküsyon prosedürünü modifiye edilmiş cihazla kullanarak, FPI etkisinin gelişmiş hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği elde edildi¹³. Modifiye edilmiş çarpma tertibatı, kafatası kraniyotomisi ols...

Tartışmalar

TBI, kapalı ve nüfuz eden olmak üzere iki ana tipe atıfta bulunur ve ikincisi kafatasının ve dura materin bozulması ile karakterize edilir. Klinik veriler, CHI'lerin penetran yaralanmalardan daha yaygın olduğunu göstermektedir ^1,2. Tek bir hafif TBH'den sonra, çoğu hasta tipik olarak kısa bir süre içinde düzelen PKS semptomları yaşar ve PKS'si uzun süreli sekellere dönüşen hastaların oranı ile ilgili tartışmalar vardır^...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% ethanol	Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.	220502
Buprenorphine hydrochloride	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd	H12020272	Solution, Analgesic
Carprofen	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Powder, Analgesic
Chlorhexidine digluconate	Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.	18472-51-0	19%-21% aqueous solution, Antimicrobial
Dental cement and solvent kit	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3#	Powder reconsituted in matching solvent
Dissecting microscope	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Erythromycin ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	220412	Antibiotic
Fiber Optic Cold Light Source	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
Flat-tipped micro-drill bit	Shenzhen RWD Life Science Inc.	HM31008	2 mm, steel
FPI device software	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR mice	Jinhua Laboratory Animal Center	Stock#2023091	25 Male mice, 25-30g, 8 weeks old
Isoflurane	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.	2023090501
Isothermal heating pad	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Custom made using a 19G needle hub
Micro hand-held skull drill	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38,000rpm
Modified FPI device	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris water maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63031	Evaluate mouse spatial learning and memory abilities
Open field	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Evaluate mouse locomoation and anxiety
Ophthalmic lubricant	Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.	SC230724B
Sodium diclofenac ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	221207	nonsteroidal anti-inflammatory drug
Small animal anesthesia system-Enhanced	Shenzhen RWD Life Science Inc.	R530IP
Smart video-tracking system	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	Animal tracking and analysis
Stereotactic frame	Shenzhen RWD Life Science Inc.	68043
Vetbond Tissue Adhesive	3M, St Paul, MN, USA	202402AX	Suture the animal wound
Y maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Evaluate mouse spatial working memory