Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג מודל עכברי שונה של פגיעה מוחית טראומטית קלה חוזרת ונשנית (rmTBI) הנגרמת באמצעות שיטת פגיעת ראש סגור (CHI). הגישה כוללת חלון גולגולת דליל וכלי הקשה נוזליים כדי להפחית את הדלקת הנגרמת בדרך כלל על ידי חשיפה לקרומי המוח, יחד עם שיפור יכולת השחזור והדיוק במידול rmTBI במכרסמים.

Abstract

פגיעה מוחית טראומטית קלה היא הפרעה נוירולוגית הטרוגנית מאוד מבחינה קלינית. מודלים של פגיעה מוחית טראומטית (TBI) הניתנים לשחזור גבוה עם פתולוגיות מוגדרות היטב נחוצים בדחיפות לחקר המנגנונים של נוירופתולוגיה לאחר פגיעה מוחית טראומטית קלה ולבדיקת טיפולים. שכפול כל הסקאלה של TBI במודלים של בעלי חיים הוכח כאתגר. לכן, הזמינות של מודלים מרובים של בעלי חיים של פגיעה מוחית טראומטית נחוצה כדי להסביר את ההיבטים והחומרה המגוונים שנצפו אצל מטופלי TBI. CHI היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לייצור מודלים של מכרסמים של rmTBI. עם זאת, שיטה זו רגישה לגורמים רבים, כולל שיטת ההשפעה בה נעשה שימוש, עובי וצורה של עצם הגולגולת, דום נשימה בבעלי חיים, וסוג תמיכת הראש והאימוביליזציה בה נעשה שימוש. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים שילוב של חלון גולגולת דליל ושיטות פציעה של כלי הקשה נוזליים (FPI) כדי לייצר מודל עכבר מדויק של rmTBI הקשור ל- CHI. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא למזער גורמים שעלולים להשפיע על הדיוק והעקביות של מידול CHI ו- FPI, כולל עובי עצם הגולגולת, צורתה ותמיכת הראש. על-ידי שימוש בשיטה של חלון גולגולת דליל, דלקת פוטנציאלית כתוצאה מקרניוטומיה ו-FPI ממוזערת, והתוצאה היא מודל עכבר משופר שמשכפל את המאפיינים הקליניים שנצפו במטופלים עם TBI קל. תוצאות מניתוח התנהגותי והיסטולוגי באמצעות צביעת המטוקסילין ואוזין (HE) מצביעות על כך ש-rmTBI יכול להוביל לפגיעה מצטברת שמייצרת שינויים הן בהתנהגות והן במורפולוגיה הגסה של המוח. בסך הכל, rmTBI הקשור ל-CHI שעבר שינוי מציג כלי שימושי לחוקרים לחקור את המנגנונים הבסיסיים שתורמים לשינויים פתופיזיולוגיים מוקדיים ומפוזרים ב-rmTBI.

Introduction

פגיעה מוחית טראומטית קלה, כולל זעזוע מוח ותת-זעזוע מוח, מהווה את רוב מקרי TBI (>80% מכלל הפגיעה המוחית המוחית טראומטית)1. פגיעה מוחית טראומטית קלה נגרמת בדרך כלל מנפילות, תאונות דרכים, מעשי אלימות, ספורט מגע (למשל, כדורגל, אגרוף, הוקי) ולחימה צבאית 2,3. פגיעה מוחית טראומטית קלה יכולה להוביל לאירועים נוירוביולוגיים המשפיעים על תפקודים נוירו-התנהגותיים לאורך חיי המטופל ולהגביר את הסיכון למחלות נוירודגנרטיביות 4,5,6. מודלים של בעלי חיים מספקים אמצעי יעיל ומבוקר לחקר TBI קלה, בתקווה לשפר עוד יותר את האבחון והטיפול ב-TBI קלה. פותחו מודלים שונים לפגיעה מוחית טראומטית קלה, כגון פגיעה מבוקרת בקליפת המוח (CCI), ירידה במשקל (WD), פגיעה בכלי הקשה בנוזלים (FPI) ומודליםשל פיצוץ-TBI 7,8. אין מודל ניסויי יחיד שיכול לחקות את כל המורכבות של פתולוגיה הנגרמת על ידי TBI 9,10. ההטרוגניות של מודלים אלה מועילה לטיפול בתכונות המגוונות הקשורות לחולי TBI קלים ולחקירת המנגנונים התאיים והמולקולריים המתאימים. אולם לכל מודל של פגיעה מוחית טראומטית בבעלי חייםיש מגבלות 3, המגבילות את הידע הנוכחי שלנו בנוגע לפגיעה מוחית טראומטית קלה בבעלי חיים ואת הרלוונטיות הקלינית שלהם.

המודלים של WD ו-CCI משמשים לשכפול מצבים קליניים כגון אובדן רקמה מוחית, המטומה תת-דוראלית חריפה, פגיעה אקסונלית, זעזוע מוח, תפקוד לקוי של מחסום הדם-מוח ואפילו תרדמת לאחר TBI 3,11,12. מודל WD כרוך בגרימת נזק מוחי על ידי פגיעה בדורה מאטר או בגולגולת עם משקולות הנופלות בחופשיות. ההשפעה של חפץ משוקלל על גולגולת שלמה יכולה לשכפל פציעות מוקדיות/מפוזרות מעורבות; עם זאת, שיטה זו קשורה לדיוק ירוד וחזרתיות של אתר הפציעה, פציעת ריבאונד ושיעור תמותה גבוה יותר עקב שברים בגולגולת 3,11,12. מודל CCI כולל שימוש במתכת מונעת אוויר כדי לפגוע ישירות בדורה מאטר החשוף. בהשוואה לדגם WD, מודל CCI מדויק יותר וניתן לשחזור, אך הוא אינו מייצר פגיעה דיפוזית בשל הקוטר הקטן של קצה11 הפוגע. במהלך מידול FPI, רקמת המוח נעקרת לזמן קצר ומעוותת על ידי כלי הקשה. FPI יכול לגרום לפגיעה מוקדית/מפושטת מעורבת ולשכפל דימום תוך גולגולתי, נפיחות במוח ונזק מתקדם לחומר אפור לאחר TBI. עם זאת, ל-FPI יש שיעור תמותה גבוה עקב נזק לגזע המוח ודום נשימה ממושך 3,12. הקרניוטומיה המעורבת במודלים קונבנציונליים של WD, CCI ו- FPI עלולה להוביל לחבלה בקליפת המוח, נגעים דימומים, נזק למחסום הדם-מוח, חדירת תאי חיסון, הפעלת תאי גלייה, זמן מידול ממושך ותוצאות קטלניות אפשריות 3,12.

TBI קלה מאופיינת בציון GCS (סולם תרדמת גלזגו, GCS) בטווח של 13 עד 152. פגיעה מוחית טראומטית קלה יכולה להיות מוקדית או מפוזרת, והיא קשורה הן לפציעות אקוטיות, כגון פירוק הומאוסטזיס תאי, אקסיטוטוקסיות, דלדול גלוקוז, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, הפרעה בזרימת הדם ונזק אקסונלי, כמו גם פציעות תת-חריפות, כולל נזק אקסונלי, דלקת עצבית וגליוזיס 2,3. למרות התקדמות משמעותית בתיאור הפתופיזיולוגיה המורכבת של TBI, המנגנונים הבסיסיים של TBI/rmTBI קלים נותרו חמקמקים ודורשים חקירה נוספת9. בהתחשב בכך ש-CHI הוא הסוג הנפוץ ביותר של TBI12, פרוטוקול זה מציג גישה חדשנית ליצירת מודל עכבר מבוקר בצורה מדויקת יותר של rmTBI באמצעות התקן FPI שונה לביצוע פגיעה בחלון גולגולת דליל13. על ידי הימנעות מפציעות הנגרמות על ידי קרניוטומיה, עובי גולגולת משתנה ואי דיוקים הנגרמים על ידי צורה, ופציעות ריבאונד, גישה זו שואפת להתגבר על החסרונות העיקריים הקשורים למודלים WD, CCI ו- FPI. יישום השפעת FPI על חלון הגולגולת הדק נוח להערכת נזק לכלי דם מוחיים בעקבות rmTBI ועוזר למזער שיעורי תמותה גבוהים במודלים מסוימים, וכתוצאה מכך דומה יותר למאפיינים הקליניים של חולי TBI.

Protocol

כל ההליכים המעורבים בפרוטוקול זה בוצעו תחת אישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אוניברסיטת ג'ג'יאנג הרגילה, מספר היתר, dw2019005) ובהתאם ל- ARRIVE ולמדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. מפרט טכני ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. נוהל טיפול בבעלי חיים

  1. לשכן עכברים בסביבה מבוקרת עם טמפרטורה של 22-24 מעלות צלזיוס, לחות הנעה בין 40%-60%, מחזור אור/חושך של 12 שעות, ולספק גישה אד ליביטטום למים וצ'או עכבר סטנדרטי. לצורך ניסוי זה נעשה שימוש ב-25 עכברי ICR זכרים (בני 25-30 גרם, בני 8 שבועות).
  2. הקצו את העכברים באופן אקראי לקבוצת הביקורת (n=12) או לקבוצת rmTBI (n=13). כדי למנוע תוקפנות פוטנציאלית מעכברי דמה כלפי עכברים שעברו rmTBI, הפרידו אותם בכלובים נפרדים.
  3. תנו לעכברים לפחות שבוע להתאקלם בסביבת הכלוב שלהם לפני תחילת הניסוי. תקופת הסתגלות זו מבטיחה שהעכברים יכירו את סביבתם וממזערת את ההשפעות האפשריות של לחץ או חרדה על תגובות פיזיולוגיות או התנהגותיות במהלך המחקר.

2. הכנת מכשיר TBI

  1. ייצור מודל rmTBI בעכברים באמצעות התקן FPI שונה (ראה טבלת חומרים; איור 1A) 13. לפני השימוש במכשיר FPI, בדוק היטב את כל החיבורים לאיתור סימני דליפה או סדיקה, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לצמתים שבין הצילינדר לצינור, ובין המחבר התלת-כיווני לצינור. כדי לקבוע את לחצי הפגיעה במדויק, הותקן מתמר לחץ עד לנקודת הפגיעה במכשיר הפגיעה בנוזלהקשה 13.
  2. ערכו בדיקה קפדנית של התקן ה-FPI כדי לוודא שהבוכנה נעה בצורה חלקה בתוך הצילינדר ושההשפעות יכולות להתבצע ביעילות (איור 1B). ודא שאין בועות אוויר בתוך המערכת. אם מזוהות בועות אוויר, יש להוסיף בזהירות מים מזוקקים למערכת באמצעות מזרק 50 מ"ל ולסלק את בועות האוויר על ידי דחיפה מהירה של מוט הצילינדר דרך מחבר תלת כיווני סמוך ו/או דרך המזרק.
    הערה: מערכת FPI מורכבת ממים מזוקקים בתוך הגליל וצינורות מחוברים. חיוני לכייל את המכשיר לפני הפעולה כדי להבטיח דיוק ואמינות של התוצאות.

3. הכנת גולגולת מדוללת

הערה: אין לבצע ניתוח בעלי חיים והכנת גולגולת מדוללת לאור עכברים אחרים. חלון הגולגולת הדליל שימושי להערכת נזק לכלי דם מוחיים לאחר הליך FPI.

  1. לעמוד בדרישות מרכז החי על ידי הנחיית מפעיל הניסוי ללבוש חלוק סטרילי ומסכה במהלך כל הליכי הטיפול בבעלי חיים.
  2. יש לחטא את משטח ספסל המעבדה, מכשיר ה-FPI, צינורות ההרדמה והחלל הנגדי הסמוך לפני תחילת הניסוי באמצעות תרסיס אתנול 70%.
  3. שקלו את העכברים הן בקבוצת הדמה והן בקבוצת ה-rmTBI לפני הניתוח והשוו את משקלם לאלה שתועדו שבוע לפני הניסוי. אל תכלול במחקר כל עכבר המציג בריאות לקויה כגון פרווה גסה, שלשולים, ירידה במשקל או עייפות. בנוסף, אין לכלול עכברים ששוקלים פחות מ-20 גרם כדי להבטיח את יכולתם לסבול פגיעות חוזרות. אמצעים אלה חיוניים לשמירה על רווחת בעלי החיים ולהבטחת תוצאות ניסוי אמינות.
  4. מרדימים עכברים עם איזופלורן 4%-5% (ב-100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה) למשך 3-4 דקות בתא זירוז. יש לתת חומר סיכה אופתלמי (ראו טבלת חומרים) לעיני בעל החיים כדי לשמור על שימון לאורך כל הניתוח. כדי להקל על הכאב, יש לתת בופרנורפין תת עורית (0.05 מ"ג/ק"ג) בנקודת האמצע בין האוזניים 20 דקות לפני ההרדמה ולאחר מכן כל 6 שעות למשך 24 שעות. יתר על כן, בתום ההרדמה, יש לתת מנה תת עורית אחת של 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן לכל בעל חיים.
  5. יש לחטא את הראש לאחר שהעכבר איבד את רפלקסי הנסיגה הימניים והדוושות. חותכים את הפרווה על ראש העכבר באמצעות מספריים כירורגיים ומשתמשים במכונת גילוח כדי להסיר את הפרווה שנותרה. יש לחטא את הקרקפת בשלושה מריחה רציפה של 2% כלורהקסידין, בשילוב עם 75% פילינג אתנול.
  6. הניחו כרית כירורגית סטרילית חד פעמית מתחת לבעל החיים וסביבתו כדי להבטיח היגיינה נאותה. בצעו חתך בקוטר 1.5 ס"מ בעזרת מספריים כירורגיים קטנים לאורך קו האמצע של קרקפת העכבר כדי לחשוף באופן מלא את אתר הניתוח (איור 2A).
  7. אבטחו את העכבר באמצעות מוטות אוזניים לא טרמינליים במסגרת סטריאוטקסית קונבנציונלית (ראו טבלת חומרים). התאם את מיקום ראש העכבר במסגרת סטריאוטקסית ברמה שטוחה או בזווית הטיה קלה בהתאם לאזור המטרה הספציפי שייחקר. יש לנקות את הפרווה מאזור הניתוח כדי למנוע דלקת בהמשך.
  8. שמור על טמפרטורת הגוף של העכבר על 37 ° C באמצעות כרית חימום איזותרמית קונבנציונלית (ראה טבלה של חומרים).
  9. במהלך תהליך ההתקנה של מרכז הניתוח והאימפקט (Luer Lock נשי), יש לשמור על הרדמת עכבר (ללא תגובה לצביטת הבוהן או הזנב) עם חרוט אף המספק ריכוז איזופלורן רציף של 2%, המווסת על ידי וופורייזר מכויל.
  10. נקו את אזור הניתוח סביב חלון הגולגולת הדק בזהירות באמצעות צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח.
  11. צרו חלון גולגולת דק, בקוטר של כ-2.5 מ"מ ובעובי של 20 מיקרומטר, בקליפת המוח המוטורית הקדמית הימנית באמצעות מקדח מיקרו שטוח (ראו טבלת חומרים, איור 2B) ולהב מיקרו-כירורגי. מקמו את אתר הניתוח בקוטר 1.5 מ"מ קדמי לברגמה ו-1.3-2.0 מ"מ רוחבי לקו האמצע (איור 2C).
    1. כדי למנוע ממקדח המיקרו לחדור לגולגולת במהלך יצירת חלון הגולגולת הדליל, יש להרטיב לסירוגין את הגולגולת במי מלח תוך כדי שחיקה עם מקדחת המיקרו.
    2. אשרו את עובי הגולגולת על ידי חיטוט עדין בגולגולת הדקה עם הקצה השטוח של מחט מזרק עדינה והערכת רכותה. להעריך את הבהירות של micro-vessels קליפת המוח חשופים חזותית כדי לקבוע את עובי הגולגולת.
    3. כדי לוודא את עובי הגולגולת, יש למרוח מי מלח סטריליים על האזור הדליל ולבדוק ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ נתיחה קונבנציונלי (ראו טבלת חומרים). טכניקה זו יכולה לעזור להבטיח כי הגולגולת היתה מדוללת כראוי.
      הערה: יש לשמן את עין העכבר לאורך כל תהליך הכנת הגולגולת הדקה ומידול rmTBI כדי למנוע התייבשות. דילול הגולגולת לפחות מ-15 מיקרומטר טומן סיכון לטראומה קלה בקליפת המוח, שעלולה לגרום לדלקת קלה בקליפת המוח14.
  12. חברו מנעול Luer נקבי מותאם (בקוטר פנימי של 2.2 מ"מ, שנוצר ממרכז מחטים של 19G, כפי שמוצג באיור 2D) לאתר הגולגולת הדלילה. אבטחו את מנעול Luer באמצעות דבק וצמנט דנטלי (איור 2E).
    הערה: כאשר משתמשים בדבק כדי לאבטח את מנעול הלואר הנשי לאזור שמסביב לחלון הגולגולת הדלילה, חשוב לייבש היטב את אזור הגולגולת, ולמנוע מהדבק להיכנס לחלון עצמו. דבק בתוך החלון יכול להפחית באופן משמעותי את כוח ההשפעה של FPI.

4. הליך מידול rmTBI הקשור ל- CHI

  1. הציגו את rmTBI באמצעות שיטת כלי ההקשה של הנוזל הצידי עם התקן FPI שונה כפי שתואר קודם לכן13,15.
  2. לאחר השלמת חלון הגולגולת הדק ונהלי רכזת ההשפעה, העבר את העכבר מהמנגנון הסטריאוטקסי לפלטפורמת המשפיעה.
  3. בהתחשב בהשפעות האפשריות של הרדמה על זמן רפלקס התיקון של בעלי חיים וחומרת הפציעה לאחר הקשה 9,16, עקבו אחר עומק ההרדמה על-ידי הערכת רפלקסי הנסיגה של המישוש והכפות (איור 2F).
  4. חברו את נקבת Luer Lock, שהודבקה על חלון הגולגולת הדלילה, לזכר Luer Lock בקצה צינורות מכשיר ה-FPI (איור 2G).
    הערה: במידול rmTBI, ההרדמה הנגרמת על ידי איזופלורן בעכברים הייתה ממושכת עקב השראת דום נשימה וחוסר הכרה על ידי כלי הקשה.
  5. הציגו שתי TBI קלות (מרווח של 48 שעות) עם ההתקן שהשתנה. יש לבצע את פגיעת ה-FPI הראשונה מיד לאחר השלמת ניתוח חלון גולגולת דליל והתקנת מנעול Luer. בצעו את השפעת ה-FPI רק לאחר שהעכבר מראה חזרה של רפלקס נסיגה לצביטה בכפה בכל פעם (איור 2H). החלת השפעת FPI בעכברים מורדמים עמוקות עלולה לגרום לדום נשימה ממושך ולמוות.
    1. כדי להחיל את השפעת FPI, הרם את המטוטלת לדרגה המיועדת לאורך המושך במכשיר ושחרר את המטוטלת באמצעות בקרת תוכנה13,15. ההשפעה צריכה להגיע לעוצמת הקשה של 2.0 ± 0.1 אטמוספרה, בהתאם לפרוטוקולים מבוססים המשמשים במחקרי מכרסמים 10,17,18. אין לכלול בעלי חיים בבדיקות נוספות אם הפגיעה לא נרשמה בין 1.9-2.1 אטמוספירה או אם שבר בגולגולת התרחש במהלך FPI.
    2. עבור עכברי הדמה, קבע אותם על המנגנון, אך אל תעביר את הפגיעה.
  6. לאחר הפגיעה, נתקו מיד את חיבור Luer Lock והעבירו עכברים לכרית חימום איזותרמית לצורך התאוששות. לאחר שהעכבר חוזר לערנות ולהכרה, החזירו אותו לכלוב הביתי שלו מבלי להסיר את מנעול הלואר הנקבי. נהל את השפעת ה- FPI השנייה, באותו אופן, 48 שעות מאוחר יותר.
  7. לאחר בדיקת ה-rmTBI, הסירו בזהירות את מנעול הלואר הנשי ואת מלט השיניים. תפרו את הקרקפת באמצעות דבק רקמות והשתמשו במלקחיים שטוחים כדי לצבוט את הקרקפת כדי להקל על תהליך ההדבקה (ראו טבלת חומרים; איור 2I).
  8. כדי למנוע דלקת, זיהום ולהקל על כאבים ואי נוחות לאחר הניתוח, יש למרוח תערובת של משחה אריתרומיצין ונתרן דיקלופנק ביחס של 1:1 (ראו טבלת חומרים) על הפצע. מעבירים עכברים לכרית חימום איזותרמית להתאוששות.
  9. רשום את משך הזמן של רפלקס הימין, שמתחיל כאשר העכבר מוסר מהמנגנון הסטריאוטקסי ומונח לרוחב על פלטפורמת ההשפעה עבור FPI וממשיך עד שהעכבר יכול לעמוד זקוף באופן עצמאי.
  10. לאחר שהעכבר חוזר לערנות ולהכרה, החזירו אותו לכלוב הביתי שלו. עכברים בדרך כלל נמצאים בהכרה מלאה ומסוגלים ללכת תוך שעה וחצי לאחר הפציעה.
  11. בימים שלאחר מידול TBI יש לבחון בעכברים סימנים שונים, כולל דפוסי נשימה, נוכחות של ריר סביב האף והפה, ואדמומיות, נפיחות, הפרשה או פתיחה מחדש של אזור הפצע. אין לכלול בעלי חיים במחקר עם אחד או יותר מהתסמינים החריגים לעיל.
    הערה: קדם-מיקרו-הזרקה של AAV-GCaMP6s מאפשרת תצפית על הומאוסטזיס עצבי Ca2+ בסיסי ועוררות בקליפת המוח הפגועה דרך חלון הגולגולת הדק באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני15.

5. בדיקת מבוך מים מוריס (MWM)

הערה: MWM (ראו טבלת חומרים) היא שיטה מוכרת להערכת למידה מרחבית וליקויי זיכרון בעכברים לאחר TBI.

  1. בצע את בדיקת MWM החל מ-7 ימים לאחר הפציעה (DPI). הבריכה העגולה של MWM הייתה בקוטר של 120 ס"מ וגובה של 50 ס"מ, כאשר טמפרטורת המים נשמרה על 25 מעלות צלזיוס. מפרידים את הבריכה המעגלית לארבעה רבעים, כאשר משטח המילוט, משטח עגול בקוטר 6 ס"מ וגובה 30 ס"מ, שקוע 1 ס"מ מתחת לפני המים ברביע הצפוני-מזרחי.
  2. מקם מצלמה ישירות מעל הבריכה המעגלית כדי לתעד את מסלול התנועה של העכברים. סמן את העכברים עם סרט שחור על גבם כדי להקל על זיהוי על ידי תוכנת רכישת התמונה ולהקלטת נתונים, כולל השהיה, מרחק השחייה ומסלול התנועה.
  3. הכניסו את העכברים למים, כשפניהם לקיר הפנימי של כל אחד מארבעת הרבעים, פעם אחת לכל רביע. ברגע שהעכברים מוצאים את הרציף, הרשו להם לנוח שם במשך 10 שניות. אם עכבר לא מצליח למצוא את הפלטפורמה תוך 60 שניות, בקש מהמפעיל להנחות את העכבר לפלטפורמה, לאפשר לו לנוח על הפלטפורמה במשך 10 שניות, ולאחר מכן להחזיר את העכבר לכלוב הביתי שלו למנוחה.
  4. חזור על כל עכבר על גירסת הניסיון לרכישה 4 פעמים ביום. לאחר ניסויי הרכישה, ב-12 DPI, ערכו ניסוי גשושית מרחבית של 60 שניות ותיעדו את מספר הפעמים שהעכברים חצו את אזור הפלטפורמה המקורי ואת משך השהייה של העכבר ברביע שבו נמצאה הפלטפורמה.
  5. לאחר כל ניסוי, יבשו במהירות את העכברים עם מגבת או הניחו מתחת למנורה מחממת כדי לשמור על טמפרטורת גופם ולמנוע היפותרמיה במהלך ניסוי הרכישה של שנות ה-60 מ-DPI 7 ל-DPI 11.
  6. לאחר השלמת הליכי הניסוי המתוארים לעיל, מרדימים את העכברים עם pentobarbital (45 מ"ג / ק"ג, כלומר p.) ב 13 DPI. תמיסת מלח איזוטונית טרנסקרדילית, ואחריה זילוח עם 4% פרפורמאלדהיד במי מלח חוצצים פוספט (pH 7.2). אחזר את המוח עבור צביעת HE קונבנציונלית כדי להעריך שינויים גס במורפולוגיה של קליפת המוח וההיפוקמפוס. תיאור מפורט של פרוטוקול הצביעה של HE ניתן למצוא בפרסומים קודמים13,15.
  7. לאחר השלמת כל הניסויים, יש להרדים עכבר על ידי הזרקת מנת יתר של פנטוברביטל (≥100 מ"ג/ק"ג, כלומר אם אין צורך בדגימות עכבר. לפני קצירת רקמות או להיפטר הפגר, לפקח על העכבר עד שאין פעימות לב לפחות 60 שניות.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר במחקר זה מתאר שיטה להשראת rmTBI דרך חלון גולגולת דליל, אשר מציעה פתרון לפגיעה המוחית הנגרמת על ידי הכנת קרניוטומיה במהלך מידול TBI קונבנציונלי של כלי הקשה. על ידי שימוש בהליך הקשה נוזלי שונה זה עם המכשיר ששונה, הושגו דיוק משופר ויכולת שחזור של השפעת FPI13. למשפיע השו...

Discussion

TBI מתייחס לשני סוגים עיקריים, סגורים וחודרים, כאשר האחרון מאופיין בהפרעה בגולגולת ובדורה מאטר. נתונים קליניים מצביעים על כך ש- CHIs שכיחים יותר מפציעות חודרות 1,2. לאחר פגיעה מוחית טראומטית קלה אחת, רוב החולים חווים תסמיני PCS שבדרך כלל חולפים תוך פרק זמן קצר, ויש ...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המפתח לפיתוח חברתי של עיריית ג'ינהואה (מס '2020-3-071), תוכנית ההכשרה לחדשנות ויזמות של סטודנטים במכללת ג'ג'יאנג (לא: S202310345087, S202310345088) ופרויקט תוכנית פעילות החדשנות של תלמידי ג'ג'יאנג במכללה המחוזית ג'ג'יאנג (2023R404044). המחברים מודים למיס אמה אויאנג (סטודנטית שנה א' באוניברסיטת ג'ונס הופקינס, תואר ראשון במדעים, בולטימור, ארה"ב) על עריכת המאמר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
75% ethanol Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd. 220502
Buprenorphine hydrochlorideTianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., LtdH12020272Solution, Analgesic
CarprofenShanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd53716-49-7Powder, Analgesic
Chlorhexidine digluconateShanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.18472-51-019%-21% aqueous solution, Antimicrobial
Dental cement and solvent kitShanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.20220405, 3#Powder reconsituted in matching solvent
Dissecting microscopeShenzhen RWD Life Science Inc.77019
Erythromycin ointment Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.220412Antibiotic
Fiber Optic Cold Light SourceShenzhen RWD Life Science Inc.F-150C
Flat-tipped micro-drill bit Shenzhen RWD Life Science Inc.HM310082 mm, steel
FPI device softwareJiaxing Bocom Biotech Inc.Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR miceJinhua Laboratory Animal Center  Stock#202309125 Male mice, 25-30g, 8 weeks old
IsofluraneShandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd. 2023090501
Isothermal heating pad Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd. 
Luer Loc hupCustom made using a 19G needle hub
Micro hand-held skull drillShenzhen RWD Life Science Inc.78001Max: 38,000rpm
Modified FPI deviceJiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris water mazeShenzhen RWD Life Science Inc.63031Evaluate mouse spatial learning and memory abilities
Open fieldShenzhen RWD Life Science Inc.63008Evaluate mouse locomoation and anxiety
Ophthalmic lubricant Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd. SC230724B
Sodium diclofenac ointment Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.221207nonsteroidal anti-inflammatory drug
Small animal anesthesia system-Enhanced Shenzhen RWD Life Science Inc.R530IP
Smart video-tracking systemPanlab Harvard Apparatus Inc., MA, USAV3.0Animal tracking and analysis
Stereotactic frame Shenzhen RWD Life Science Inc.68043
Vetbond Tissue Adhesive3M, St Paul, MN, USA202402AXSuture the animal wound
Y mazeShenzhen RWD Life Science Inc.63005Evaluate mouse spatial working memory

References

  1. Jiang, J. Y., et al. Traumatic brain injury in china. Lancet Neurol. 18 (3), 286-295 (2019).
  2. Naumenko, Y., Yuryshinetz, I., Zabenko, Y., Pivneva, T. Mild traumatic brain injury as a pathological process. Heliyon. 9 (7), e18342 (2023).
  3. Zhao, Q., Zhang, J., Li, H., Li, H., Xie, F. Models of traumatic brain injury-highlights and drawbacks. Front Neurol. 14, 1151660 (2023).
  4. Grant, D. A., et al. Repeat mild traumatic brain injury in adolescent rats increases subsequent β-amyloid pathogenesis. J Neurotrauma. 35 (1), 94-104 (2018).
  5. Clark, A. L., et al. Repetitive mtbi is associated with age-related reductions in cerebral blood flow but not cortical thickness. J Cereb Blood Flow Metab. 41 (2), 431-444 (2021).
  6. Mcallister, T., Mccrea, M. Long-term cognitive and neuropsychiatric consequences of repetitive concussion and head-impact exposure. J Athl Train. 52 (3), 309-317 (2017).
  7. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
  8. Pham, L., et al. proteomic alterations following repeated mild traumatic brain injury: Novel insights using a clinically relevant rat model. Neurobiol Dis. 148, 105151 (2021).
  9. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated mild traumatic brain injury: Potential mechanisms of damage. Cell Transplant. 26 (7), 1131-1155 (2017).
  10. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Mol Neurobiol. 56 (8), 5332-5345 (2019).
  11. Freeman-Jones, E., Miller, W. H., Work, L. M., Fullerton, J. L. Polypathologies and animal models of traumatic brain injury. Brain Sci. 13 (12), 1709 (2023).
  12. Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: A review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Exp Brain Res. 239 (10), 2939-2950 (2021).
  13. Ouyang, W., et al. Modified device for fluid percussion injury in rodents. J Neurosci Res. 96 (8), 1412-1429 (2018).
  14. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
  15. Liu, Y., Fan, Z., Wang, J., Dong, X., Ouyang, W. Modified mouse model of repeated mild traumatic brain injury through a thinned-skull window and fluid percussion. J Neurosci Res. 101 (10), 1633-1650 (2023).
  16. Bolton-Hall, A. N., Hubbard, W. B., Saatman, K. E. Experimental designs for repeated mild traumatic brain injury: Challenges and considerations. J Neurotrauma. 36 (8), 1203-1221 (2019).
  17. Aleem, M., Goswami, N., Kumar, M., Manda, K. Low-pressure fluid percussion minimally adds to the sham craniectomy-induced neurobehavioral changes: Implication for experimental traumatic brain injury model. Exp Neurol. 329, 113290 (2020).
  18. Katz, P. S., Molina, P. E. A lateral fluid percussion injury model for studying traumatic brain injury in rats. Methods Mol Biol. 1717, 27-36 (2018).
  19. Xiong, B., et al. Precise cerebral vascular atlas in stereotaxic coordinates of whole mouse brain. Front Neuroanat. 11, 128 (2017).
  20. Hoogenboom, W. S., et al. Evolving brain and behaviour changes in rats following repetitive subconcussive head impacts. Brain Commun. 5 (6), 316 (2023).
  21. Lipton, M. L., et al. Soccer heading is associated with white matter microstructural and cognitive abnormalities. Radiology. 268 (3), 850-857 (2013).
  22. Rubin, T. G., et al. Mri-defined white matter microstructural alteration associated with soccer heading is more extensive in women than men. Radiology. 289 (2), 478-486 (2018).
  23. Mcinnes, K., Friesen, C. L., Mackenzie, D. E., Westwood, D. A., Boe, S. G. Mild traumatic brain injury (mtbi) and chronic cognitive impairment: A scoping review. PLoS One. 12 (4), e0174847 (2017).
  24. Marschner, L., et al. Single mild traumatic brain injury results in transiently impaired spatial long-term memory and altered search strategies. Behav Brain Res. 365, 222-230 (2019).
  25. Hoogenboom, W. S., Branch, C. A., Lipton, M. L. Animal models of closed-skull, repetitive mild traumatic brain injury. Pharmacol Ther. 198, 109-122 (2019).
  26. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: A systematic review. J Athl Train. 55 (2), 132-158 (2020).
  27. Fidan, E., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in the developing brain: Effects on long-term functional outcome and neuropathology. J Neurotrauma. 33 (7), 641-651 (2016).
  28. Nguyen, T., et al. Repeated closed-head mild traumatic brain injury-induced inflammation is associated with nociceptive sensitization. J Neuroinflammation. 20 (1), 196 (2023).
  29. Ren, H., et al. Enriched endogenous omega-3 fatty acids in mice ameliorate parenchymal cell death after traumatic brain injury. Mol Neurobiol. 54 (5), 3317-3326 (2017).
  30. Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. J Bone Miner Res. 31 (2), 299-307 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CHIFPIRmTBI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved