Modello murino modificato di lesione cerebrale traumatica lieve ripetitiva che incorpora finestra cranica assottigliata e percussione fluida

Riepilogo

Questo protocollo presenta un modello murino modificato di lesione cerebrale traumatica lieve ripetitiva (rmTBI) indotta tramite un metodo di lesione cranica chiusa (CHI). L'approccio presenta una finestra cranica assottigliata e una percussione fluida per ridurre l'infiammazione comunemente causata dall'esposizione alle meningi, insieme a una migliore riproducibilità e accuratezza nella modellazione dell'rmTBI nei roditori.

Abstract

La lesione cerebrale traumatica lieve è un disturbo neurologico clinicamente molto eterogeneo. Modelli animali di lesione cerebrale traumatica (TBI) altamente riproducibili con patologie ben definite sono urgentemente necessari per studiare i meccanismi della neuropatologia dopo trauma cranico lieve e testare le terapie. Replicare tutte le sequele del trauma cranico nei modelli animali si è rivelata una sfida. Pertanto, la disponibilità di più modelli animali di trauma cranico è necessaria per tenere conto dei diversi aspetti e gravità osservati nei pazienti con trauma cranico. CHI è uno dei metodi più comuni per fabbricare modelli di roditori di rmTBI. Tuttavia, questo metodo è suscettibile a molti fattori, tra cui il metodo di impatto utilizzato, lo spessore e la forma dell'osso del cranio, l'apnea animale e il tipo di supporto per la testa e l'immobilizzazione utilizzati. Lo scopo di questo protocollo è dimostrare una combinazione dei metodi FPI (Fluid Covered Window) e Fluid Percussion Injury (FPI) per produrre un modello murino preciso di rmTBI associato a CHI. L'obiettivo principale di questo protocollo è ridurre al minimo i fattori che potrebbero influire sull'accuratezza e sulla coerenza della modellazione CHI e FPI, tra cui lo spessore, la forma e il supporto della testa dell'osso del cranio. Utilizzando un metodo della finestra cranica assottigliata, la potenziale infiammazione dovuta alla craniotomia e all'FPI è ridotta al minimo, ottenendo un modello murino migliorato che replica le caratteristiche cliniche osservate nei pazienti con trauma cranico lieve. I risultati dell'analisi comportamentale e istologica utilizzando la colorazione con ematossilina ed eosina (HE) suggeriscono che l'rmTBI può portare a una lesione cumulativa che produce cambiamenti sia nel comportamento che nella morfologia grossolana del cervello. Nel complesso, l'rmTBI modificato associato a CHI rappresenta uno strumento utile per i ricercatori per esplorare i meccanismi sottostanti che contribuiscono ai cambiamenti fisiopatologici focali e diffusi nell'rmTBI.

Introduzione

Il trauma cranico lieve, tra cui commozione cerebrale e sub-commozione cerebrale, rappresenta la maggior parte di tutti i casi di trauma cranico (>80% di tutti i trauma cranico)¹. Il trauma cranico lieve deriva comunemente da cadute, incidenti stradali, atti di violenza, sport di contatto (ad es. calcio, boxe, hockey) e combattimenti militari ^2,3. Un trauma cranico lieve può portare a eventi neurobiologici che influenzano le funzioni neurocomportamentali per tutta la vita del paziente e aumentano il rischio di malattie neurodegenerative ^4,5,6. I modelli animali forniscono un mezzo efficiente e controllato per studiare il trauma cranico lieve, con la speranza di migliorare ulteriormente la diagnosi e il trattamento del trauma cranico lieve. Sono stati sviluppati vari modelli per il trauma cranico lieve, come l'impatto corticale controllato (CCI), la caduta di peso (WD), la lesione da percussione del fluido (FPI) e i modelli blast-TBI ^7,8. Nessun singolo modello sperimentale può imitare l'intera complessità della patologia indotta da TBI ^9,10. L'eterogeneità di questi modelli è vantaggiosa per affrontare le diverse caratteristiche associate ai pazienti con trauma cranico lieve e studiare i corrispondenti meccanismi cellulari e molecolari. Tuttavia, ogni modello animale di trauma cranico ha i suoi limiti³, limitando le nostre attuali conoscenze riguardo al trauma cranico lieve animale e alla loro rilevanza clinica.

I modelli WD e CCI sono utilizzati per replicare condizioni cliniche come la perdita di tessuto cerebrale, l'ematoma subdurale acuto, la lesione assonale, la commozione cerebrale, la disfunzione della barriera emato-encefalica e persino il coma dopo TBI ^3,11,12. Il modello WD prevede l'induzione di danni cerebrali colpendo la dura madre o il cranio con pesi che cadono liberamente. L'impatto di un oggetto ponderato su un cranio intatto può replicare lesioni miste focali/diffuse; Tuttavia, questo metodo è associato a scarsa precisione e ripetibilità del sito della lesione, lesioni da rimbalzo e un tasso di mortalità più elevato a causa di fratture del cranio ^3,11,12. Il modello CCI prevede l'applicazione di metallo azionato ad aria per colpire direttamente la dura madre esposta. Rispetto al modello WD, il modello CCI è più accurato e riproducibile, ma non produce lesioni diffuse a causa del piccolo diametro della punta d'impatto¹¹. Durante la modellazione FPI, il tessuto cerebrale viene brevemente spostato e deformato dalla percussione. L'FPI può indurre lesioni miste focali/diffuse e replicare l'emorragia intracranica, il gonfiore cerebrale e il danno progressivo della materia grigia dopo trauma cranico. Tuttavia, l'FPI ha un alto tasso di mortalità a causa del danno del tronco encefalico e dell'apnea prolungata ^3,12. La craniotomia coinvolta nei modelli convenzionali di WD, CCI e FPI può portare a contusione corticale, lesioni emorragiche, danni alla barriera emato-encefalica, infiltrazione di cellule immunitarie, attivazione delle cellule gliali, tempo di modellazione prolungato e possibili esiti fatali ^3,12.

Il trauma cranico lieve è caratterizzato da un punteggio GCS (Glasgow coma scale, GCS) compreso tra 13 e 15². Il trauma cranico lieve può essere focale o diffuso ed è associato sia a lesioni acute, come la rottura dell'omeostasi cellulare, l'eccitotossicità, la deplezione di glucosio, la disfunzione mitocondriale, il disturbo del flusso sanguigno e il danno assonale, sia a lesioni subacute, tra cui danno assonale, neuroinfiammazione e gliosi ^2,3. Nonostante i progressi significativi nel delineare l'intricata fisiopatologia del trauma cranico, i meccanismi alla base del trauma cranico/rmTBI lieve rimangono sfuggenti e richiedono ulteriori indagini⁹. Dato che il CHI è il tipo più comune di TBI¹², questo protocollo presenta un nuovo approccio alla creazione di un modello murino di rmTBI controllato in modo più preciso utilizzando un dispositivo FPI modificato per eseguire l'impatto in una finestra cranica assottigliata¹³. Evitando lesioni indotte dalla craniotomia, lo spessore variabile del cranio e le imprecisioni indotte dalla forma e le lesioni da rimbalzo, questo approccio mira a superare i principali svantaggi associati ai modelli WD, CCI e FPI. L'applicazione dell'impatto FPI sulla finestra del cranio assottigliato è utile per valutare il danno ai vasi cerebrali dopo rmTBI e aiuta a ridurre al minimo gli alti tassi di mortalità in alcuni modelli, risultando in una maggiore somiglianza con le caratteristiche cliniche dei pazienti con trauma cranico.

Protocollo

Tutte le procedure coinvolte in questo protocollo sono state eseguite sotto l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (Zhejiang Normal University, Numero di Permesso, dw2019005) e in conformità con l'ARRIVE e la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Le specifiche tecniche sono riportate nella Tabella dei Materiali.

1. Procedura di manipolazione degli animali

1. I topi domestici in un ambiente controllato con una temperatura di 22-24 °C, umidità compresa tra il 40% e il 60%, un ciclo luce/buio di 12 ore e forniscono un accesso ad libitum all'acqua e al cibo standard per topi. Ai fini di questo esperimento, sono stati utilizzati 25 topi maschi ICR (25-30 g, 8 settimane di età).
2. Assegna casualmente i topi nel gruppo di controllo (n=12) o nel gruppo rmTBI (n=13). Per prevenire potenziali aggressioni da parte di topi fittizi nei confronti di quelli sottoposti a rmTBI, separarli in gabbie distinte.
3. Dai ai topi almeno 1 settimana per acclimatarsi all'ambiente della gabbia prima di iniziare l'esperimento. Questo periodo di acclimatazione assicura che i topi acquisiscano familiarità con l'ambiente circostante e minimizzi i potenziali impatti dello stress o dell'ansia sulle risposte fisiologiche o comportamentali durante lo studio.

2. Preparazione del dispositivo TBI

1. Fabbricare il modello rmTBI nei mouse utilizzando un dispositivo FPI modificato (vedi Tabella dei materiali; Figura 1A) ¹³. Prima di utilizzare il dispositivo FPI, ispezionare attentamente tutti i collegamenti per rilevare eventuali segni di perdite o crepe, prestando particolare attenzione alle giunzioni tra il cilindro e il tubo e tra il connettore a tre vie e il tubo. Per determinare con precisione le pressioni di impatto, è stato installato un trasduttore di pressione fino al punto di impatto sul dispositivo di lesione a percussione del fluido¹³.
2. Condurre un'attenta ispezione del dispositivo FPI per assicurarsi che il pistone si muova agevolmente all'interno del cilindro e che gli impatti possano essere condotti in modo efficace (Figura 1B). Verificare che non siano presenti bolle d'aria all'interno del sistema. Se vengono rilevate bolle d'aria, aggiungere con cautela acqua distillata al sistema utilizzando una siringa da 50 ml ed espellere le bolle d'aria spingendo rapidamente lo stelo del cilindro attraverso un connettore a 3 vie vicino e/o attraverso la siringa.
   NOTA: Il sistema FPI è costituito da acqua distillata all'interno del cilindro e dai tubi collegati. È fondamentale calibrare il dispositivo prima dell'uso per garantire l'accuratezza e l'affidabilità dei risultati.

3. Preparazione del cranio assottigliato

NOTA: La chirurgia animale e la preparazione del cranio assottigliato non devono essere eseguite in vista di altri topi. La finestra del cranio assottigliata è utile per valutare il danno ai vasi cerebrali a seguito di una procedura FPI.

1. Rispettare i requisiti del centro per animali istruendo l'operatore sperimentale a indossare un camice e una maschera sterili durante tutte le procedure di manipolazione degli animali.
2. Igienizzare il banco di lavoro del laboratorio, il dispositivo FPI, il tubo anestetico e il controspazio adiacente prima di iniziare l'esperimento utilizzando uno spray di etanolo al 70%.
3. Pesare i topi in entrambi i gruppi sham e rmTBI prima dell'intervento chirurgico e confrontare i loro pesi con quelli registrati 1 settimana prima dell'esperimento. Escludere dallo studio tutti i topi che mostrano cattive condizioni di salute come pelliccia ruvida, diarrea, perdita di peso o letargia. Inoltre, escludere i topi che pesano meno di 20 g per garantire la loro capacità di tollerare impatti ripetuti. Queste misure sono fondamentali per mantenere il benessere degli animali e garantire risultati sperimentali affidabili.
4. Anestetizzare i topi con isoflurano al 4%-5% (in ossigeno al 100% a una velocità di flusso di 1 L/min) per 3-4 minuti in una camera di induzione. Somministrare un lubrificante oftalmico (vedi Tabella dei materiali) agli occhi dell'animale per mantenere la lubrificazione durante l'intervento chirurgico. Per attenuare il dolore, somministrare buprenorfina per via sottocutanea (0,05 mg/kg) nel punto medio tra le orecchie 20 minuti prima dell'anestesia e successivamente ogni 6 ore per una durata di 24 ore. Inoltre, al termine dell'anestesia, somministrare una singola dose sottocutanea di 5 mg/kg di carprofene a ciascun animale.
5. Disinfettare la testa dopo che il mouse ha perso i riflessi di raddrizzamento e di ritiro del pedale. Taglia il pelo sulla testa del topo usando le forbici chirurgiche e usa un rasoio per rimuovere il pelo rimanente. Disinfettare il cuoio capelluto con tre applicazioni sequenziali di clorexidina al 2%, intervallate da scrub al 75% di etanolo.
6. Posizionare un cuscinetto chirurgico sterile monouso sotto l'animale e l'area circostante per garantire una corretta igiene. Praticare un'incisione di 1,5 cm utilizzando una piccola forbice chirurgica sottile lungo la linea mediana del cuoio capelluto del topo per esporre completamente il sito chirurgico (Figura 2A).
7. Fissare il mouse utilizzando le barre auricolari non terminali in un telaio stereotassico convenzionale (vedere la tabella dei materiali). Regolare la posizione della testa del mouse in un fotogramma stereotassico a un livello piatto o a un angolo leggermente inclinato in base all'area target specifica che verrà indagata. Pulisci il pelo dall'area chirurgica per evitare infiammazioni in seguito.
8. Mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C utilizzando un termoforo isotermico convenzionale (vedi Tabella dei materiali).
9. Durante il processo di installazione chirurgica e dell'hub d'impatto (Luer Lock femmina), mantenere l'anestesia del topo (senza risposta al pizzicamento della punta o della coda) con un cono nasale che eroga una concentrazione continua di isoflurano del 2%, regolata da un vaporizzatore calibrato.
10. Pulire accuratamente l'area chirurgica intorno alla finestra del cranio assottigliato utilizzando un batuffolo di cotone sterile imbevuto di soluzione salina.
11. Creare una finestra del cranio assottigliata, di circa 2,5 mm di diametro e 20 μm di spessore, nella corteccia motoria frontale destra utilizzando una micropunta da microtrapano a punta piatta (vedi Tabella dei materiali, Figura 2B) e una lama microchirurgica. Localizzare il sito chirurgico a 1,5 mm anteriormente alla bregma e a 1,3-2,0 mm lateralmente alla linea mediana (Figura 2C).
    1. Per evitare che la micro-fresa penetri nel cranio durante la creazione della finestra del cranio assottigliata, inumidire a intermittenza il cranio con soluzione salina mentre si macina con la micro-perforazione.
    2. Confermare lo spessore del cranio sondando delicatamente il cranio assottigliato con la punta appiattita di un ago da siringa sottile e valutandone la morbidezza. Stimare visivamente la chiarezza dei microvasi corticali esposti per determinare lo spessore del cranio.
    3. Per verificare lo spessore del cranio, applicare soluzione fisiologica sterile sull'area assottigliata e ispezionare visivamente utilizzando un microscopio da dissezione convenzionale (vedi Tabella dei materiali). Questa tecnica può aiutare a garantire che il cranio sia stato adeguatamente assottigliato.
       NOTA: Lubrificare l'occhio del topo durante l'intera preparazione del cranio assottigliato e la procedura di modellazione rmTBI per evitare che si secchi. L'assottigliamento del cranio a meno di 15 μm comporta il rischio di un lieve trauma corticale che può provocare una lieve infiammazione corticale¹⁴.
12. Collegare un Luer Lock femmina regolato (diametro interno di 2,2 mm, creato da un mozzo dell'ago 19G, come mostrato nella Figura 2D) al sito del cranio assottigliato. Fissare il Luer Lock con colla e cemento dentale (Figura 2E).
    NOTA: Quando si utilizza la colla per fissare il Luer lock femmina all'area intorno alla finestra del cranio assottigliato, è fondamentale asciugare accuratamente l'area del cranio e impedire all'adesivo di entrare nella finestra stessa. L'adesivo all'interno della finestra può ridurre significativamente la forza d'impatto dell'FPI.

4. Procedura di modellazione rmTBI associata a CHI

1. Introdurre rmTBI utilizzando il metodo della percussione fluida laterale con un dispositivo FPI modificato come descritto in precedenza^13,15.
2. Dopo aver completato le procedure della finestra del cranio assottigliato e dell'hub d'impatto, trasferire il topo dall'apparato stereotassico alla piattaforma dell'impattatore.
3. Dati i potenziali effetti dell'anestesia sul tempo del riflesso di raddrizzamento dell'animale e sulla gravità della lesione dopo la percussione ^9,16, monitorare la profondità dell'anestesia valutando i riflessi palpebrale e di ritiro della zampa (Figura 2F).
4. Collegare il Luer Lock femmina, che è stato incollato sulla finestra del cranio assottigliato, al Luer Lock maschio all'estremità del tubo del dispositivo FPI (Figura 2G).
   NOTA: Nella modellazione rmTBI, l'anestesia indotta da isoflurano nei topi è stata prolungata a causa dell'induzione di apnea e perdita di coscienza per percussione.
5. Introdurre due TBI lievi (intervallo di 48 ore) con il dispositivo modificato. Applicare il primo impatto FPI subito dopo aver completato l'intervento chirurgico della finestra del cranio assottigliato e aver installato il Luer Lock. Somministrare l'impatto FPI solo quando il topo mostra il ritorno di un riflesso di ritiro a un pizzico della zampa in ogni occasione (Figura 2H). L'applicazione di un impatto FPI in topi profondamente anestetizzati può causare apnea prolungata e morte.
   1. Per applicare l'impatto FPI, sollevare il pendolo al grado designato lungo il goniometro sul dispositivo e rilasciare il pendolo utilizzando il controllo software^13,15. L'impatto dovrebbe raggiungere un'intensità di percussione di 2,0 ± 0,1 atm, seguendo i protocolli stabiliti utilizzati negli studi sui roditori 10,17,18. Escludere gli animali da ulteriori test se l'impatto non è stato registrato tra 1,9 e 2,1 atm o se si è verificata una frattura del cranio durante l'FPI.
   2. Per i topi finti, fissarli sull'apparecchio, ma non erogare l'impatto.
6. Dopo l'impatto, staccare immediatamente la connessione Luer Lock e trasferire i mouse su un termoforo isotermico per il recupero. Dopo che il topo ha riacquistato allerta e coscienza, riportalo nella sua gabbia di casa senza rimuovere il Luer lock femmina. Somministrare il secondo impatto FPI, allo stesso modo, 48 ore dopo.
7. Dopo l'rmTBI, rimuovere con cautela il Luer lock femmina e il cemento dentale. Sutura il cuoio capelluto con adesivo per tessuti e utilizzare una pinza piatta per pizzicare il cuoio capelluto per facilitare il processo di adesività (vedi Tabella dei materiali; Figura 2I).
8. Per prevenire l'infiammazione, l'infezione e alleviare il dolore e il disagio post-operatorio, applicare una miscela di eritromicina e unguento di diclofenac sodico in un rapporto 1:1 (vedi Tabella dei materiali) sulla ferita. Trasferisci i topi su un termoforo isotermico per il recupero.
9. Registrare la durata del riflesso raddrizzante, che inizia quando il mouse viene rimosso dall'apparato stereotassico e posizionato lateralmente sulla piattaforma di impattamento per FPI e continua fino a quando il mouse può stare in piedi in modo indipendente.
10. Dopo che il topo ha riacquistato la vigilanza e la coscienza, riportalo nella sua gabbia di casa. I topi sono in genere completamente coscienti e in grado di camminare entro 1,5 ore dopo la lesione.
11. Nei giorni successivi alla modellazione del trauma cranico, osservare i topi per vari segni, tra cui modelli di respirazione, presenza di muco intorno al naso e alla bocca e arrossamento, gonfiore, essudati o riapertura dell'area della ferita. Escludere dallo studio gli animali con uno o più dei sintomi anomali di cui sopra.
    NOTA: La pre-microiniezione di AAV-GCaMP6s consente l'osservazione dell'omeostasi neuronale del Ca2+ sottostante e dell'eccitabilità nella corteccia lesa attraverso la finestra del cranio assottigliata utilizzando la microscopia a scansione laser a due fotoni¹⁵.

5. Test del labirinto d'acqua di Morris (MWM)

NOTA: Il MWM (vedi Tabella dei materiali) è un metodo ampiamente riconosciuto per valutare l'apprendimento spaziale e i deficit di memoria nei topi dopo trauma cranico.

1. Condurre il test MWM a partire da 7 giorni dopo l'infortunio (DPI). La piscina circolare del MWM aveva un diametro di 120 cm e un'altezza di 50 cm, con la temperatura dell'acqua mantenuta a 25 °C. Separare la piscina circolare in quattro quadranti, con la piattaforma di fuga, una piattaforma rotonda con un diametro di 6 cm e un'altezza di 30 cm, sommersa 1 cm sotto la superficie dell'acqua nel quadrante nord-est.
2. Posiziona una telecamera direttamente sopra la piscina circolare per registrare la traiettoria di movimento dei topi. Contrassegnare i topi con del nastro adesivo nero sulla schiena per facilitare il riconoscimento da parte del software di acquisizione delle immagini e per la registrazione dei dati, tra cui la latenza, la distanza di nuoto e la traiettoria del movimento.
3. Metti i topi nell'acqua, rivolti verso la parete interna di ciascuno dei quattro quadranti, una volta per ogni quadrante. Una volta che i topi hanno trovato la piattaforma, lasciali riposare lì per 10 secondi. Se un topo non riesce a trovare la piattaforma entro 60 s, chiedi all'operatore di guidare il topo verso la piattaforma, lasciarlo riposare sulla piattaforma per 10 s, quindi riportare il topo nella sua gabbia di casa per riposare.
4. Ripetere per ogni mouse la prova di acquisizione 4 volte al giorno. Dopo le prove di acquisizione, su 12 DPI, condurre un esperimento di sonda spaziale di 60 s e registrare il numero di volte in cui i topi hanno attraversato l'area della piattaforma originale e la durata della permanenza del topo nel quadrante in cui si trovava la piattaforma.
5. Dopo ogni prova, asciugare rapidamente i topi con un asciugamano o posizionarli sotto una lampada riscaldante per mantenere la temperatura corporea e prevenire l'ipotermia durante la prova di acquisizione di 60 secondi da DPI 7 a DPI 11.
6. Dopo il completamento delle procedure sperimentali sopra descritte, anestetizzare i topi con pentobarbital (45 mg/kg, i.p.) a 13 DPI. Soluzione salina isotonica perfusa per via transcardiaca, seguita da perfusione con paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,2). Recuperare il cervello per la colorazione HE convenzionale per valutare le alterazioni della morfologia corticale e ippocampale. Una descrizione dettagliata del protocollo di colorazione HE può essere trovata nelle pubblicazioni precedenti^13,15.
7. Dopo che tutti gli esperimenti sono stati completati, sopprimere il topo mediante iniezione di pentobarbital per sovradosaggio (≥100 mg/kg, i.p.) se non sono necessari campioni di topo. Prima di raccogliere i tessuti o smaltire la carcassa, monitorare il topo fino a quando non c'è battito cardiaco per almeno 60 s.

Risultati

Il protocollo descritto in questo studio delinea un metodo per indurre rmTBI attraverso una finestra cranica assottigliata, che offre una soluzione alla lesione cerebrale causata dalla preparazione della craniotomia durante la modellazione convenzionale del trauma cranico a percussione. Utilizzando questa procedura di percussione fluida modificata con il dispositivo modificato, sono state ottenute una maggiore precisione e riproducibilità dell'impatto FPI¹³. L'impattatore modificato ha la versati...

Discussione

Il trauma cranico si riferisce a due tipi primari, chiusi e penetranti, con quest'ultimo caratterizzato da una rottura del cranio e della dura madre. I dati clinici suggeriscono che i CHI sono più diffusi delle lesioni penetranti ^1,2. Dopo un singolo trauma cranico lieve, la maggior parte dei pazienti manifesta sintomi di PCS che in genere si risolvono in un breve periodo di tempo e c'è controversia riguardo alla percentuale di pazienti il cui PCS si sviluppa i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% ethanol	Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.	220502
Buprenorphine hydrochloride	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd	H12020272	Solution, Analgesic
Carprofen	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Powder, Analgesic
Chlorhexidine digluconate	Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.	18472-51-0	19%-21% aqueous solution, Antimicrobial
Dental cement and solvent kit	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3#	Powder reconsituted in matching solvent
Dissecting microscope	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Erythromycin ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	220412	Antibiotic
Fiber Optic Cold Light Source	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
Flat-tipped micro-drill bit	Shenzhen RWD Life Science Inc.	HM31008	2 mm, steel
FPI device software	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR mice	Jinhua Laboratory Animal Center	Stock#2023091	25 Male mice, 25-30g, 8 weeks old
Isoflurane	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.	2023090501
Isothermal heating pad	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Custom made using a 19G needle hub
Micro hand-held skull drill	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38,000rpm
Modified FPI device	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris water maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63031	Evaluate mouse spatial learning and memory abilities
Open field	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Evaluate mouse locomoation and anxiety
Ophthalmic lubricant	Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.	SC230724B
Sodium diclofenac ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	221207	nonsteroidal anti-inflammatory drug
Small animal anesthesia system-Enhanced	Shenzhen RWD Life Science Inc.	R530IP
Smart video-tracking system	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	Animal tracking and analysis
Stereotactic frame	Shenzhen RWD Life Science Inc.	68043
Vetbond Tissue Adhesive	3M, St Paul, MN, USA	202402AX	Suture the animal wound
Y maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Evaluate mouse spatial working memory