Modelo de ratón modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva que incorpora ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos

Resumen

Este protocolo presenta un modelo murino modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva (rmTBI) inducida a través de un método de lesión craneal cerrada (CHI). El enfoque presenta una ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos para reducir la inflamación comúnmente causada por la exposición a las meninges, junto con una mejor reproducibilidad y precisión en el modelado de rmTBI en roedores.

Resumen

El traumatismo craneoencefálico leve es un trastorno neurológico clínicamente muy heterogéneo. Se necesitan urgentemente modelos animales de lesiones cerebrales traumáticas (TCE) altamente reproducibles con patologías bien definidas para estudiar los mecanismos de la neuropatología después de un TCE leve y probar terapias. Replicar todas las secuelas del TCE en modelos animales ha demostrado ser un desafío. Por lo tanto, es necesaria la disponibilidad de múltiples modelos animales de TCE para dar cuenta de los diversos aspectos y severidades observados en los pacientes con TCE. CHI es uno de los métodos más comunes para fabricar modelos de roedores de rmTBI. Sin embargo, este método es susceptible a muchos factores, incluido el método de impacto utilizado, el grosor y la forma del hueso del cráneo, la apnea animal y el tipo de soporte e inmovilización de la cabeza utilizados. El objetivo de este protocolo es demostrar una combinación de los métodos de ventana de cráneo adelgazado y lesión por percusión fluida (FPI) para producir un modelo de ratón preciso de rmTBI asociado a CHI. El objetivo principal de este protocolo es minimizar los factores que podrían afectar la precisión y la consistencia del modelado de CHI y FPI, incluido el grosor del hueso del cráneo, la forma y el soporte de la cabeza. Al utilizar un método de ventana de cráneo adelgazado, se minimiza la inflamación potencial debido a la craneotomía y la FPI, lo que da como resultado un modelo de ratón mejorado que replica las características clínicas observadas en pacientes con TCE leve. Los resultados del análisis conductual e histológico utilizando la tinción de hematoxilina y eosina (HE) sugieren que el RMTBI puede conducir a una lesión acumulativa que produce cambios tanto en el comportamiento como en la morfología macroscópica del cerebro. En general, el rmTBI modificado asociado a CHI presenta una herramienta útil para que los investigadores exploren los mecanismos subyacentes que contribuyen a los cambios fisiopatológicos focales y difusos en el rmTBI.

Introducción

Las lesiones cerebrales traumáticas leves, incluidas las conmociones cerebrales y las subconmociones cerebrales, representan la mayoría de todos los casos de lesiones cerebrales traumáticas (>80% de todas las lesiones cerebrales traumáticas)¹. Las lesiones cerebrales traumáticas leves suelen ser el resultado de caídas, accidentes de tráfico, actos de violencia, deportes de contacto (p. ej., fútbol, boxeo, hockey) y combates militares ^2,3. El TCE leve puede provocar eventos neurobiológicos que afectan las funciones neuroconductuales a lo largo de la vida del paciente y aumentan el riesgo de enfermedades neurodegenerativas ^4,5,6. Los modelos animales proporcionan un medio eficaz y controlado para estudiar el TCE leve, con la esperanza de mejorar aún más el diagnóstico y el tratamiento del TCE leve. Se han desarrollado varios modelos para el TCE leve, como el impacto cortical controlado (CCI), la caída de peso (WD), la lesión por percusión líquida (FPI) y los modelos de TBI por explosión ^7,8. Ningún modelo experimental puede imitar toda la complejidad de la patología inducida por TCE ^9,10. La heterogeneidad de estos modelos es ventajosa para abordar las diversas características asociadas con los pacientes con TCE leve e investigar los mecanismos celulares y moleculares correspondientes. Sin embargo, cada modelo animal de TCE tiene sus limitaciones³, lo que limita nuestro conocimiento actual sobre el TCE leve en animales y su relevancia clínica.

Los modelos WD y CCI se utilizan para replicar condiciones clínicas como pérdida de tejido cerebral, hematoma subdural agudo, lesión axonal, conmoción cerebral, disfunción de la barrera hematoencefálica e incluso coma después de un TCE ^3,11,12. El modelo WD consiste en inducir daño cerebral al golpear la duramadre o el cráneo con pesos que caen libremente. El impacto de un objeto pesado sobre un cráneo intacto puede replicar lesiones mixtas focales/difusas; Sin embargo, este método se asocia con poca precisión y repetibilidad del sitio de la lesión, lesión de rebote y una mayor tasa de mortalidad por fracturas de cráneo ^3,11,12. El modelo CCI consiste en aplicar metal accionado por aire para impactar directamente la duramadre expuesta. En comparación con el modelo WD, el modelo CCI es más preciso y reproducible, pero no produce lesiones difusas debido al pequeño diámetro de la punta impactadora¹¹. Durante el modelado FPI, el tejido cerebral se desplaza brevemente y se deforma por percusión. La FPI puede inducir una lesión mixta focal/difusa y replicar la hemorragia intracraneal, la hinchazón del cerebro y el daño progresivo de la materia gris después de un traumatismo craneal. Sin embargo, la FPI tiene una alta tasa de mortalidad debido al daño del tronco encefálico y a la apnea prolongada ^3,12. La craneotomía involucrada en los modelos convencionales de WD, CCI y FPI puede conducir a contusión cortical, lesiones hemorrágicas, daño de la barrera hematoencefálica, infiltración de células inmunitarias, activación de células gliales, tiempo de modelado prolongado y posibles resultados fatales ^3,12.

El TCE leve se caracteriza por una puntuación GCS (escala de coma de Glasgow, GCS) dentro del rango de 13 a 15². El TCE leve puede ser focal o difuso y se asocia tanto con lesiones agudas, como la ruptura de la homeostasis celular, excitotoxicidad, depleción de glucosa, disfunción mitocondrial, alteración del flujo sanguíneo y daño axonal, como con lesiones subagudas, como daño axonal, neuroinflamación y gliosis ^2,3. A pesar de los avances significativos en la delineación de la compleja fisiopatología del TCE, los mecanismos subyacentes del TCE/TCE leve siguen siendo difíciles de alcanzar y requieren más investigación⁹. Dado que el CHI es el tipo más común de TCE¹², este protocolo presenta un enfoque novedoso para crear un modelo de ratón controlado con mayor precisión de la LCTM rm utilizando un dispositivo FPI modificado para realizar el impacto en una ventana de cráneo adelgazado¹³. Al evitar las lesiones inducidas por la craneotomía, el grosor variable del cráneo y las imprecisiones inducidas por la forma, así como las lesiones de rebote, este enfoque pretende superar las principales desventajas asociadas con los modelos WD, CCI y FPI. La aplicación del impacto de la FPI en la ventana del cráneo adelgazada es conveniente para evaluar el daño de los vasos cerebrales después de la RMT-TBI y ayuda a minimizar las altas tasas de mortalidad en algunos modelos, lo que resulta en una mayor semejanza con las características clínicas de los pacientes con TBI.

Protocolo

Todos los procedimientos involucrados en este protocolo se realizaron bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Universidad Normal de Zhejiang, Número de Permiso, dw2019005) y en cumplimiento con el ARRIVE y la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Las especificaciones técnicas se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.

1. Procedimiento de manipulación de animales

1. Los ratones de casa se encuentran en un ambiente controlado con una temperatura de 22-24 °C, una humedad que oscila entre el 40% y el 60%, un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y proporcionan acceso ad libitum al agua y a la comida estándar para ratones. Para el propósito de este experimento, se utilizaron 25 ratones machos ICR (25-30 g, 8 semanas de edad).
2. Asigne aleatoriamente los ratones al grupo de control (n = 12) o al grupo rmTBI (n = 13). Para prevenir la posible agresión de los ratones falsos hacia los ratones que se sometieron a RMTBI, sepárelos en jaulas distintas.
3. Dé a los ratones al menos 1 semana para que se aclimaten a su entorno de jaula antes de comenzar el experimento. Este período de aclimatación asegura que los ratones se familiaricen con su entorno y minimiza los impactos potenciales del estrés o la ansiedad en las respuestas fisiológicas o conductuales durante el estudio.

2. Preparación del dispositivo TBI

1. Fabricar el modelo rmTBI en ratones utilizando un dispositivo FPI modificado (ver Tabla de Materiales; Figura 1A) ¹³. Antes de usar el dispositivo FPI, inspeccione cuidadosamente todas las conexiones en busca de signos de fugas o grietas, prestando especial atención a las uniones entre el cilindro y la tubería, y entre el conector de tres vías y la tubería. Para determinar con precisión las presiones de impacto, se instaló un transductor de presión hasta el punto de impacto en el dispositivo de lesión por percusión de fluido¹³.
2. Realice una inspección cuidadosa del dispositivo FPI para asegurarse de que el pistón se mueva suavemente dentro del cilindro y que los impactos se puedan realizar de manera efectiva (Figura 1B). Verifique que no haya burbujas de aire presentes dentro del sistema. Si se detectan burbujas de aire, agregue con cuidado agua destilada al sistema con una jeringa de 50 ml y expulse las burbujas de aire empujando rápidamente la varilla del cilindro a través de un conector de 3 vías cercano y/o a través de la jeringa.
   NOTA: El sistema FPI consiste en agua destilada dentro del cilindro y tubería conectada. Es crucial calibrar el dispositivo antes de operarlo para garantizar la precisión y confiabilidad de los resultados.

3. Preparación del cráneo adelgazado

NOTA: La cirugía con animales y la preparación del cráneo adelgazado no deben realizarse a la vista de otros ratones. La ventana del cráneo adelgazado es útil para evaluar el daño de los vasos cerebrales después de un procedimiento de FPI.

1. Cumplir con los requisitos del centro de animales instruyendo al operador experimental para que use una bata y mascarilla estériles durante todos los procedimientos de manejo de animales.
2. Desinfecte la mesa de laboratorio, el dispositivo FPI, el tubo anestésico y el contraespacio adyacente antes de comenzar el experimento con un aerosol de etanol al 70%.
3. Pesar a los ratones en los grupos simulado y rmTBI antes de la cirugía y comparar sus pesos con los registrados 1 semana antes del experimento. Excluya del estudio a cualquier ratón que muestre mala salud, como pelaje áspero, diarrea, pérdida de peso o letargo. Además, excluya a los ratones que pesen menos de 20 g para garantizar su capacidad de tolerar impactos repetidos. Estas medidas son cruciales para mantener el bienestar animal y garantizar resultados experimentales fiables.
4. Anestesiar ratones con isoflurano al 4%-5% (en oxígeno al 100% a un caudal de 1 L/min) durante 3-4 min en una cámara de inducción. Administrar un lubricante oftálmico (ver Tabla de Materiales) en los ojos del animal para mantener la lubricación durante toda la cirugía. Para mitigar el dolor, administrar buprenorfina por vía subcutánea (0,05 mg/kg) en el punto medio entre las orejas 20 min antes de la anestesia y posteriormente cada 6 h durante 24 h. Además, al final de la anestesia, administrar una dosis subcutánea única de 5 mg/kg de carprofeno a cada animal.
5. Desinfecte la cabeza después de que el ratón haya perdido sus reflejos de enderezamiento y retirada del pedal. Recorta el pelaje de la cabeza del ratón con unas tijeras quirúrgicas y usa una afeitadora para quitar el pelaje restante. Desinfecte el cuero cabelludo con tres aplicaciones secuenciales de clorhexidina al 2%, intercaladas con exfoliantes de etanol al 75%.
6. Coloque una almohadilla quirúrgica estéril desechable debajo del animal y el área circundante para garantizar una higiene adecuada. Realice una incisión de 1,5 cm con una tijera quirúrgica pequeña y fina a lo largo de la línea media del cuero cabelludo del ratón para exponer completamente el sitio quirúrgico (Figura 2A).
7. Asegure el ratón utilizando barras auditivas no terminales en un marco estereotáxico convencional (consulte la tabla de materiales). Ajuste la posición de la cabeza del ratón en un marco estereotáxico a un nivel plano o un ángulo ligeramente inclinado de acuerdo con el área objetivo específica que se investigará. Limpie el pelaje de la zona quirúrgica para evitar inflamaciones posteriores.
8. Mantenga la temperatura corporal del ratón a 37 °C utilizando una almohadilla térmica isotérmica convencional (consulte la tabla de materiales).
9. Durante el proceso de instalación quirúrgico y del cubo de impacto (Luer Lock hembra), mantenga la anestesia del ratón (sin respuesta al pinzamiento de la punta o la cola) con un cono de nariz que proporciona una concentración continua de isoflurano del 2%, regulada por un vaporizador calibrado.
10. Limpie cuidadosamente el área quirúrgica alrededor de la ventana del cráneo adelgazado con un hisopo de algodón estéril empapado en solución salina.
11. Cree una ventana de cráneo adelgazado, de aproximadamente 2,5 mm de diámetro y 20 μm de grosor, en la corteza motora frontal derecha utilizando una microbroca de punta plana (véase la Tabla de materiales, Figura 2B) y una cuchilla microquirúrgica. Ubicar el sitio quirúrgico a 1,5 mm anterior al bregma y 1,3-2,0 mm lateral a la línea media (Figura 2C).
    1. Para evitar que el microtaladro penetre en el cráneo durante la creación de la ventana del cráneo adelgazado, humedezca intermitentemente el cráneo con solución salina mientras muele con el microtaladro.
    2. Confirme el grosor del cráneo sondeando suavemente el cráneo adelgazado con la punta aplanada de una aguja de jeringa fina y evaluando su suavidad. Estimar visualmente la claridad de los microvasos corticales expuestos para determinar el grosor del cráneo.
    3. Para verificar el grosor del cráneo, aplique solución salina estéril en el área adelgazada e inspeccione visualmente con un microscopio de disección convencional (consulte la tabla de materiales). Esta técnica puede ayudar a asegurar que el cráneo se haya adelgazado adecuadamente.
       NOTA: Lubrique el ojo del ratón durante toda la preparación del cráneo adelgazado y el procedimiento de modelado rmTBI para evitar que se seque. El adelgazamiento del cráneo a menos de 15 μm conlleva el riesgo de un traumatismo cortical leve que puede dar lugar a una inflamación cortical leve¹⁴.
12. Fije un Luer Lock hembra ajustado (2,2 mm de diámetro interior, creado a partir de un cubo de aguja de 19G, como se muestra en la Figura 2D) en el sitio del cráneo adelgazado. Asegure el Luer Lock con pegamento y cemento dental (Figura 2E).
    NOTA: Al usar pegamento para asegurar la cerradura Luer hembra al área alrededor de la ventana del cráneo adelgazado, es crucial secar completamente el área del cráneo y evitar que el adhesivo ingrese a la ventana. El adhesivo dentro de la ventana puede reducir significativamente la fuerza de impacto del FPI.

4. Procedimiento de modelado de rmTBI asociado a CHI

1. Introducir rmTBI utilizando el método de percusión de fluido lateral con un dispositivo FPI modificado como se describió anteriormente^13,15.
2. Después de completar los procedimientos de ventana de cráneo adelgazado y centro de impacto, transfiera el mouse del aparato estereotáxico a la plataforma de impacto.
3. Dados los posibles efectos de la anestesia sobre el tiempo del reflejo de enderezamiento de los animales y la gravedad de la lesión después de la percusión ^9,16, monitorizar la profundidad de la anestesia evaluando los reflejos palpebrales y de retirada de las patas (Figura 2F).
4. Conecte el Luer Lock hembra, que estaba pegado a la ventana del cráneo adelgazado, al Luer Lock macho en el extremo del tubo del dispositivo FPI (Figura 2G).
   NOTA: En el modelo rmTBI, la anestesia inducida por isoflurano en ratones se prolongó debido a la inducción de apnea e inconsciencia por percusión.
5. Introduzca dos TCE leves (intervalo de 48 h) con el dispositivo modificado. Aplique el primer impacto FPI inmediatamente después de completar la cirugía de ventana de cráneo adelgazado e instalar el Luer Lock. Solo administre el impacto de FPI una vez que el ratón muestre el retorno de un reflejo de retirada a un pellizco de pata en cada ocasión (Figura 2H). La aplicación de un impacto de FPI en ratones profundamente anestesiados puede causar apnea prolongada y la muerte.
   1. Para aplicar el impacto FPI, eleve el péndulo al grado designado a lo largo del transportador en el dispositivo y suelte el péndulo usando el control de software^13,15. El impacto debe alcanzar una intensidad de percusión de 2,0 ± 0,1 atm, siguiendo los protocolos establecidos en los estudios con roedores 10,17,18. Excluir a los animales de las pruebas adicionales si el impacto no se registró entre 1,9 y 2,1 atm o si se produjo una fractura de cráneo durante la FPI.
   2. En el caso de los ratones falsos, fíjelos en el aparato, pero no provoquen el impacto.
6. Después del impacto, desconecte inmediatamente la conexión Luer Lock y transfiera los ratones a una almohadilla térmica isotérmica para su recuperación. Después de que el ratón recupere el estado de alerta y la conciencia, devuélvalo a su jaula de origen sin quitar el bloqueo Luer hembra. Administrar el segundo impacto de FPI, de la misma manera, 48 h después.
7. Después de la rmTBI, retire con cuidado el mechón Luer hembra y el cemento dental. Suturar el cuero cabelludo con adhesivo tisular y utilizar pinzas planas para pellizcar el cuero cabelludo y facilitar el proceso adhesivo (véase la Tabla de Materiales; Figura 2I).
8. Para prevenir la inflamación, la infección y aliviar el dolor y las molestias posquirúrgicas, aplique una mezcla de ungüento de eritromicina y diclofenaco de sodio en una proporción de 1:1 (ver Tabla de materiales) a la herida. Transfiera los ratones a una almohadilla térmica isotérmica para su recuperación.
9. Registre la duración del reflejo de enderezamiento, que comienza cuando el ratón se retira del aparato estereotáxico y se coloca lateralmente en la plataforma impactadora para FPI y continúa hasta que el ratón puede mantenerse en posición vertical de forma independiente.
10. Después de que el ratón recupere el estado de alerta y la conciencia, devuélvelo a su jaula de origen. Por lo general, los ratones están completamente conscientes y pueden caminar dentro de 1,5 horas después de la lesión.
11. En los días posteriores al modelado de la lesión cerebral traumática, observe a los ratones para detectar varios signos, incluidos patrones de respiración, presencia de moco alrededor de la nariz y la boca, y enrojecimiento, hinchazón, exudados o reapertura del área de la herida. Excluir del estudio a los animales que presenten uno o más de los síntomas anormales mencionados.
    NOTA: La pre-microinyección de AAV-GCaMP6s permite observar la homeostasis y excitabilidad neuronal subyacente de Ca2+ en la corteza lesionada a través de la ventana del cráneo adelgazado utilizando microscopía de barrido láser de dos fotones¹⁵.

5. Prueba del laberinto acuático de Morris (MWM)

NOTA: El MWM (ver Tabla de Materiales) es un método ampliamente reconocido para evaluar el aprendizaje espacial y los déficits de memoria en ratones después de una lesión cerebral traumática.

1. Realizar la prueba MWM a partir de los 7 días posteriores a la lesión (DPI). La piscina circular del MWM tenía un diámetro de 120 cm y una altura de 50 cm, con la temperatura del agua mantenida a 25 °C. Separe la piscina circular en cuatro cuadrantes, con la plataforma de escape, una plataforma redonda con un diámetro de 6 cm y una altura de 30 cm, sumergida 1 cm por debajo de la superficie del agua en el cuadrante noreste.
2. Coloque una cámara directamente sobre la piscina circular para registrar la trayectoria del movimiento de los ratones. Marque los ratones con cinta negra en la espalda para facilitar el reconocimiento por parte del software de adquisición de imágenes y para el registro de datos, incluida la latencia, la distancia de natación y la trayectoria del movimiento.
3. Coloque los ratones en el agua, mirando hacia la pared interior de cada uno de los cuatro cuadrantes, una vez por cada cuadrante. Una vez que los ratones encuentren la plataforma, déjelos descansar allí durante 10 segundos. Si un ratón no logra encontrar la plataforma en un plazo de 60 s, pida al operador que guíe al ratón hasta la plataforma, déjelo descansar en la plataforma durante 10 s y, a continuación, devuelva el ratón a su jaula de origen para que descanse.
4. Repita para cada ratón la prueba de adquisición 4 veces al día. Después de las pruebas de adquisición, en 12 DPI, realizó un experimento de sonda espacial de 60 s y registró el número de veces que los ratones cruzaron el área original de la plataforma y la duración de la estancia del ratón en el cuadrante donde se encontraba la plataforma.
5. Después de cada ensayo, seque rápidamente los ratones con una toalla o colóquelos debajo de una lámpara de calentamiento para mantener su temperatura corporal y prevenir la hipotermia durante la prueba de adquisición de 60 s de DPI 7 a DPI 11.
6. Después de completar los procedimientos experimentales descritos anteriormente, anestesiar a los ratones con pentobarbital (45 mg/kg, i.p.) a 13 DPI. Perfundir solución salina isotónica por vía transcárdica, seguida de perfusión con paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2). Recuperar los cerebros para la tinción convencional de HE para evaluar las alteraciones de la morfología cortical macroscópica y del hipocampo. Una descripción detallada del protocolo de tinción de HE se puede encontrar en publicaciones anteriores^13,15.
7. Una vez finalizados todos los experimentos, se debe aplicar la eutanasia al ratón mediante una inyección de pentobarbital por sobredosis (≥100 mg/kg, i.p.) si no se necesitan muestras de ratón. Antes de recolectar pañuelos o deshacerse del cadáver, controle al ratón hasta que no haya latidos cardíacos durante al menos 60 segundos.

Resultados

El protocolo descrito en este estudio describe un método para inducir RMTBI a través de una ventana de cráneo adelgazada, que ofrece una solución a la lesión cerebral causada por la preparación de la craneotomía durante el modelado convencional de TBI por percusión. Al utilizar este procedimiento de percusión de fluido modificado con el dispositivo modificado, se logró una mayor precisión y reproducibilidad del impacto de FPI¹³. El impactador modificado tiene la versatilidad para ser ut...

Discusión

El traumatismo craneoencefálico se refiere a dos tipos principales, el cerrado y el penetrante, este último caracterizado por una alteración del cráneo y la duramadre. Los datos clínicos sugieren que las CHI son más prevalentes que las lesiones penetrantes ^1,2. Después de un solo TCE leve, la mayoría de los pacientes experimentan síntomas de PCS que generalmente se resuelven en un corto período de tiempo, y existe controversia con respecto a la proporci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% ethanol	Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.	220502
Buprenorphine hydrochloride	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd	H12020272	Solution, Analgesic
Carprofen	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Powder, Analgesic
Chlorhexidine digluconate	Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.	18472-51-0	19%-21% aqueous solution, Antimicrobial
Dental cement and solvent kit	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3#	Powder reconsituted in matching solvent
Dissecting microscope	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Erythromycin ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	220412	Antibiotic
Fiber Optic Cold Light Source	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
Flat-tipped micro-drill bit	Shenzhen RWD Life Science Inc.	HM31008	2 mm, steel
FPI device software	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR mice	Jinhua Laboratory Animal Center	Stock#2023091	25 Male mice, 25-30g, 8 weeks old
Isoflurane	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.	2023090501
Isothermal heating pad	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Custom made using a 19G needle hub
Micro hand-held skull drill	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38,000rpm
Modified FPI device	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris water maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63031	Evaluate mouse spatial learning and memory abilities
Open field	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Evaluate mouse locomoation and anxiety
Ophthalmic lubricant	Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.	SC230724B
Sodium diclofenac ointment	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.	221207	nonsteroidal anti-inflammatory drug
Small animal anesthesia system-Enhanced	Shenzhen RWD Life Science Inc.	R530IP
Smart video-tracking system	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	Animal tracking and analysis
Stereotactic frame	Shenzhen RWD Life Science Inc.	68043
Vetbond Tissue Adhesive	3M, St Paul, MN, USA	202402AX	Suture the animal wound
Y maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Evaluate mouse spatial working memory