小鼠手术模型中扩展 78% 肝切除术

摘要

部分 2/3 （66%） 肝切除术的小鼠模型在文献中有很好的描述，但很少使用更扩展的肝切除术，模仿肝移植后的小尺寸综合征。我们描述了在小鼠模型中延长的 78% 肝切除术程序，该手术在健康小鼠中导致约 50% 的术后致死率。

摘要

小鼠部分 2/3 肝切除术用于研究肝脏的再生能力，并探索肝切除术在许多疾病模型中的结果。在小鼠经典的 2/3 部分肝切除术中，五个肝叶中的两个，即左叶和正中叶，约占肝脏质量的 66%，被 整体 切除，预期术后存活率为 100%。更具侵略性的部分肝切除术在技术上更具挑战性，因此很少用于小鼠。我们小组开发了一种扩展肝切除术技术的小鼠模型，其中五个肝叶中的三个，包括左、正中和右上叶，分别切除约占肝脏总质量的 78%。在其他方面健康的小鼠中，这种延长的切除术会留下残余的肝脏，不能总是维持充分和及时的再生。由于暴发性肝衰竭，未能再生最终导致 1 周内术后 50% 的致死率。这种在小鼠中延长 78% 肝切除术的手术代表了一种独特的手术模型，用于研究小尺寸综合征和评估治疗策略，以改善肝移植或癌症延长肝切除术中的肝脏再生和结果。

引言

小鼠和大鼠手术肝切除模型于 1931 年首次描述，是用于研究肝脏再生分子基础的最常见实验模型。它们还可用于转化科学研究，以测试和制定策略，以改善延长肝切除术或次优肝移植物移植后的结果 1,2,3,4。小鼠部分肝切除术 （PH） 需要切除约 2/3 （66%） 的肝质量总量 （TLM），当在健康动物中进行时，该手术具有特殊的结果⁵。该过程持续时间短，由于小鼠肝脏解剖结构变化不大，因此易于复制，术后存活率通常接近 100%¹。

部分 2/3 肝切除术包括左叶 （LL） 和正中叶 （ML） 切除术，可使残叶相对不受肺叶炎症或肝脏流入和流出限制的阻碍再生。相反，PH 后门静脉血流增加和随后对肝窦内皮细胞的剪切应力导致内皮一氧化氮合酶 （eNOS） 表达持续上调和随后的一氧化氮 （NO） 释放，这有助于肝细胞启动增殖和肝脏再生³。在疾病模型（如非酒精性脂肪性肝病）或特定遗传背景中，通常在 2/3 PH 后研究的结果包括急性肝衰竭的风险、肝脏再生能力的定性和定量测量，以及对压力或创伤性损伤的其他生物学反应 ^1,3。

然而，模仿功能性或解剖学上较小尺寸综合征的小鼠模型，因为它发生在癌症扩展肝切除术或边缘性（脂肪变性或长时间缺血时间）或部分（分裂或来自活体供体肝脏）肝移植物之后，仍有待充分建立。为了满足这一需求，需要更广泛的肝切除模型，这些模型超越了维持最小（和功能性）肝脏质量，以模拟小于大小的肝脏综合征以及与该综合征相关的高死亡率^6,7。

小鼠肝脏解剖结构表现出最小的变异。小鼠肝脏由五个肺叶组成，每个肺叶占肝脏总质量的百分比:左叶（LL;34.4±1.9%）、中叶（ML;26.2±1.9%）、右上叶（也称为右上叶）叶（RUL;16.6±1.4%）、右下叶（也称为右下叶）（RLL;14.7±1.4%）和尾状叶（CL;8.1±1.0%）^1，5.每个肺叶由一个门静脉三联征供血，包括肝动脉的一个分支、门静脉的一个分支和胆管⁵。从历史上看，有几种技术被描述为通过切除 LL 和 ML 来执行 2/3 PH。这些包括 1） 经典技术，该技术由每个切除叶的基部的单个结扎线组成;2）止血夹技术，使用钛夹应用于切除叶的基部;3）一种以血管为导向的薄壁组织保留技术，在钳夹近端使用穿刺缝合线;4） 一种以血管为导向的显微外科技术，即在肺叶切除术¹ 之前结扎门静脉和肝动脉分支。虽然每种技术都有相对的优点和缺点，但没有一种技术能产生更高的致死率^1,8,9。

在这项研究中，我们提出了一种在小鼠中延长 78% PH 值的新方法。在该模型中，五个肝叶中的三个，包括LL，ML和RUL，使用结扎技术分别切除（图1）。该手术切除约占肝脏总质量的 78%（77.2 ± 5.2%）。我们选择单独切除 LL 和 ML，而不是像经典 PH 技术那样"整体"切除，这样可以最大限度地减少与这两个叶整体切除相关的并发症，例如肝上腔静脉狭窄和当单结扎线太靠近腔静脉时，剩余叶坏死的风险增加^1， 10,11,12,13,14.在进入此过程的最后一步以删除 RUL 之前，这一点至关重要。这种在 8-12 周龄野生型 C57BL/6 小鼠中的广泛肝切除术在手术后 1 周内引起 50% 的致死率，原因是肝脏再生失败导致暴发性肝衰竭^15,16。这种在延长 78% 肝切除术后致死率升高的小鼠模型适当地概括了小尺寸综合征的病理生理学，并能够开发和测试新的策略以改善结果。

研究方案

本程序协议中描述的方法已获得贝丝以色列女执事医疗中心 （BIDMC） 的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。所有实验均按照IACUC和BIDMC动物研究设施指南完成。

1.小鼠术前准备

1. 用剪刀从胸骨中部到耻骨上区域剃掉小鼠腹部。
2. 在100%氧气中用1-4%异氟烷诱导全身麻醉。麻醉后，将小鼠仰卧在手术区域上，下面放一个加热垫。在做切口之前，用力捏住脚趾，以确保没有踏板反射（如果有，动物会做出反应）。根据需要调整麻醉水平以达到全身麻醉状态。
   注意:根据需要滴定异氟醚以维持足够的全身麻醉。
3. 皮下注射 1.2 mg/kg 丁丙诺啡缓释 （ER） 用于术后镇痛。将小鼠仰卧，前肢和后腿伸直，并用胶带固定四肢;然后，准备一个用于手术的无菌区域。
   注意: 确保前肢在固定时放松，以免呼吸受到阻碍。
4. 用温热的无菌生理盐水和甜菜碱拭子准备腹部，每个拭子之间交替 3 次。以无菌方式覆盖腹部。

2. 肝切除术

1. 使用手术刀从剑突到耻骨上区域通过皮肤做一个垂直的中线剖腹手术切口。接下来，用锋利的剪刀切开白线，进入腹膜腔，并将该切口延伸到皮肤切口的长度。
   注意:更安全的做法是先在肝脏深入腹壁的剑突下区域切开白线，以避免对下面的肠道造成伤害。
2. 使用适当的牵开器横向缩回腹壁;然后，用止血器夹住剑突，并上部缩回胸骨以暴露肝脏。
3. 将肝脏下部缩回，露出镰状韧带，然后用锋利的剪刀沿肝脏长度横切韧带。将肝脏向胸部上方缩回，露出肝胃韧带和肝叶韧带，并使用锋利的微剪刀横切这些结构。
   注意:应使用湿润的棉尖涂抹器非常轻柔地进行回缩，因为由 Glisson 胶囊包裹的肝脏非常脆弱，容易瘀伤和撕裂。
4. 上部缩回正中叶，同时保持左叶在其原始解剖位置。将 5-0 丝线缝合线缠绕在 LL 的上内侧部分，将 LL 向胸部反射，露出肺叶的下表面，将肺叶底部的缝合线末端汇合在一起，并在底部系上缝合线。在绑线以结扎 LL 之前，请确保缝合线不会阻碍下腔静脉 （IVC） 或门静脉的血流。
   注意:最好在LL向胸部反射时系扎此缝合线，以便在结扎过程中门静脉三联征很好地暴露出来。这有助于切除靠近基部的叶，而不会损害相邻结构。
5. 使用锋利的剪刀切除缝合带远端的 LL，并确保一小块组织袖带 （~2 mm） 将缝合线与切除叶的边缘分开。确认止血。
6. 将正中叶向胸部反射，在 ML 基部周围放置 5-0 丝线缝合线，然后将 ML 恢复到其原始解剖位置。将缝合线末端大致位于 ML 上部的底部，并确保将它们系在肺叶的底部。切除结扎的 ML，在缝合带周围留下一小块残余组织。确认止血。
7. 从右向左动员肝脏，露出右上叶和下叶，并小心地将这些叶反射到内侧和下侧。将 5-0 缝合线包裹在 RUL 的上内侧，以确保缝合线环绕 RUL 基部，然后将 RUL 反射到胸部。将缝合线包裹在 RUL 下方，并将末端靠近其底部，然后将其切除，在缝合带周围留下一小块残余组织。
   注意:在 RUL 底部过于靠近会损害 RLL 的血液供应，从而导致 RLL 缺血和小鼠在术后 24 小时内死亡。相反，与 RUL 基底相距太远会减少肝脏肿块切除量，从而使术后生存率超出预期。
8. 将剩余的肝脏恢复到其静止解剖位置，并确保止血。如果需要，用纱布对切除的肝脏边缘的轻微出血区域施加压力。
9. 使用 5-0 多乳素缝合线以不间断的方式闭合中线腹壁（筋膜和肌肉层）。用订书钉或 5-0 单丝缝合线闭合皮肤切口。
10. 停止麻醉并监测小鼠，直到它恢复意识并可以正常行走。

3.术后护理

1. 术后观察小鼠以确保适当的恢复（即小鼠在笼子内清醒、警觉且可以走动）和疼痛控制。每2小时检查一次小鼠，直到手术后6小时，然后每天检查一次。
   注意:预计小鼠在术后在笼子内的移动速度会较慢。小鼠应在隔离的笼子中从其他小鼠中恢复，并且只有在完全恢复时才返回到其他小鼠的陪伴下。
2. 如果小鼠因不显性液体或手术失血过多而出现低血容量，则给予温热的生理盐水注射（0.1-1.0 mL，皮下或腹膜内）。

结果

在8-12周的健康成年小鼠中，成功的78%扩展肝切除术有望在1周内诱导50%的死亡率¹⁶。如果操作得当，预计失血量最小。持续的残余出血可以通过手动压力来控制。手术后 24 小时内围手术期死亡通常是由技术错误引起的。技术故障包括大血管意外损伤导致顽固性术中出血;严重的术后出血，通常是由于切除的肝缘残留出血所致;对周围结构的损伤，例如无意中结扎了相邻的门静脉三联...

讨论

为了成功进行延长的 78% 肝切除术，导致小鼠 50% 的致死率，精确切除每个肝叶至关重要。只有重复执行该程序，才能达到这种能力和精确度水平。培训曲线因操作员而异，但通常需要 3-6 个月的实践。切除少于 78% TLM 的肝切除术将产生更高的存活率，而切除超过 78% TLM 的肝切除术将导致更高的致死率。每个肺叶切除术都具有挑战性，尽管程度不同。

左肺叶是最容易可靠切除?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x 2 Gauze	Covidien	2146	Surgery: dissection
5-O Nylon Monofilament Suture	Oasis	50-118-0631	Surgery: Skin closure
5-O Silk Suture	Fine Science Tools	18020-50	Surgery: liver lobe ligation
5-O Vicryl Suture	Ethicon	NC9335902	Surgery: Abdominal wall closure
Addson Forceps	Braintree Scientific	FC028	Surgery: dissection
Alcohol Swabs (2)	BD	326895	Disinfectant
Buprenorphine Extended Release Formulation	Zoopharm	N/A	Analgesia
Cordless Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868-14	Shaving
Curved Forceps	Braintree Scientific	FC0038	Surgery: dissection
Hemostat	Braintree Scientific	FC79-1	Surgery: dissection
Isoflurane Inhalant Anesthetic	Patterson Veterinary	RXISO-250	General Anesthesia
Magnet Fixator (2-slot) (2)	Braintree Scientific	ACD-001	Surgery: to hold small retractors
Magnet Fixator (4-slot)	Braintree Scientific	ACD-002	Surgery: to hold small retractors
Microscissors	Braintree Scientific	SC-MI 151	Surgery: dissection
Operating tray	Braintree Scientific	ACD-0014	Surgery: for establishment of surgical field
Povidone Iodine 10% Swabstick (2)	Medline	MDS093901ZZ	Disinfectant
Scalpel (15-blade)	Aspen Surgical Products	371615	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Curved)	Braintree Scientific	SC-T-406	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Straight)	Braintree Scientific	SC-T-405	Surgery: dissection
Small Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-118	Surgery: dissection
Tissue Forceps (Straight x2)	Braintree Scientific	FC1001	Surgery: dissection
Warming Pad (18" x 26")	Stryker	TP 700	Warming
Warming Pad Pump	Stryker	TP 700	Warming
Wire Handle Retractor (2)	Braintree Scientific	ACD-005	Surgery: to facilitate exposure of peritoneal cavity
Xenotec Isoflurane Small Animal Anesthesia System	Braintree Scientific	EZ-108SA	General Anesthesia: Contains Isoflurane vaborizer & console, Induction chamber, Regulator/Hose, Facemask (M)