마우스 수술 모델에서 확장된 78% 간절제술

요약

부분 2/3(66%) 간절제술의 마우스 모델은 문헌에 잘 설명되어 있지만, 간 이식 후 소형 증후군을 모방한 더 확장된 간절제술은 거의 사용되지 않았습니다. 우리는 건강한 마우스에서 약 50%의 수술 후 치사율을 초래하는 마우스 모델에서 확장된 78% 간 절제술 절차에 대해 설명합니다.

초록

생쥐의 부분 2/3 간 절제술은 간의 재생 능력을 연구하고 여러 질병 모델에서 간 절제 결과를 탐색하기 위한 연구에 사용됩니다. 생쥐의 고전적인 부분 2/3 간절제술에서는 5개의 간엽 중 2개, 즉 간 질량의 약 66%를 차지하는 좌엽과 정중엽을 일괄 적으로 절제하며 수술 후 생존율이 100%로 예상됩니다. 보다 공격적인 부분 간절제술은 기술적으로 더 까다롭기 때문에 생쥐에는 거의 사용되지 않았습니다. 우리 연구팀은 좌측, 정중엽, 우측 상엽을 포함한 5개의 간엽 중 3개를 개별적으로 절제하여 전체 간 종괴의 약 78%를 제거하는 확장 간절제술의 마우스 모델을 개발했습니다. 그렇지 않으면 건강한 쥐에서 이러한 확장된 절제는 항상 적절하고 시기적절한 재생을 유지할 수 없는 잔여 간을 남깁니다. 재생에 실패하면 결국 전격성 간부전으로 인해 1주일 이내에 수술 후 치사율이 50%에 이릅니다. 생쥐에서 78%의 간절제술을 연장하는 이 시술은 소형 증후군 연구와 간 이식 또는 암에 대한 장기 간 절제 환경에서 간 재생 및 결과를 개선하기 위한 치료 전략 평가를 위한 독특한 수술 모델을 나타냅니다.

서문

1931년에 처음 기술된 생쥐 및 쥐의 외과적 간 절제 모델은 간 재생의 분자적 기초를 연구하는 데 사용되는 가장 일반적인 실험 모델입니다. 또한 장기간의 절제 또는 차선의 간 이식 후 결과를 개선하기 위한 전략을 테스트하고 개발하기 위한 중개 과학 연구에서 유용할 수 있습니다 1,2,3,4. 생쥐에서 부분 간절제술(PH)은 총 간량(TLM)의 약 2/3(66%)를 제거하는 것을 수반하며, 건강한 동물에서 시행할 경우 탁월한 결과를 보인다⁵. 이 시술은 기간이 짧고 쥐의 간 해부학적 구조에 변화가 거의 없어 쉽게 재현할 수 있으며 수술 후 생존율은 일반적으로 100^%에 가깝습니다1.

좌엽(LL)과 정중엽(ML)의 절제를 포함하는 부분 2/3 간절제술은 잔엽 염증이나 간 유입 및 유출 제한에 의해 상대적으로 방해받지 않고 잔엽이 재생될 수 있도록 합니다. 오히려, PH에 따른 간맥 흐름의 증가와 그에 따른 간 정현파 내피 세포의 전단 스트레스는 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 발현의 지속적인 상향 조절과 그에 따른 산화질소(NO) 방출을 초래하며, 이는 증식 및 간 재생을 위한 간세포의 프라이밍에 기여합니다³. 비알코올성 지방간 질환 또는 특정 유전적 배경과 같은 질병 모델에서 PH 2/3 후 일반적으로 연구되는 결과에는 급성 간부전 위험, 간 재생 능력의 질적 및 정량적 측정, 스트레스 또는 외상성 손상에 대한 기타 생물학적 반응이 포함됩니다 ^1,3.

그러나 기능적 또는 해부학적 소형 증후군을 모방한 마우스 모델은 암에 대한 장기간의 절제술 또는 변연부(지방증 또는 장기간의 허혈성 시간) 또는 부분(분할 또는 생체 기증자의 간) 간 이식 후에 발생하기 때문에 잘 확립된 상태로 남아 있습니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 최소한의(그리고 기능적인) 간 종괴의 유지를 넘어서는 보다 광범위한 간 절제 모델은 작은 크기의 간 증후군과 이 증후군과 관련된 높은 사망률을 모델링하기 위해 필요하다 ^6,7.

쥐의 간 해부학적 구조는 최소한의 변화를 보입니다. 생쥐의 간은 5개의 엽으로 구성되어 있으며, 각 엽은 전체 간 질량에서 다음과 같은 비율을 차지합니다: 좌엽(LL; 34.4 ± 1.9%), 정중엽(ML; 26.2 ± 1.9%), 우상엽(RUL; 16.6 ± 1.4%), 우하단(우하엽이라고도 함)(RLL; 14.7 ± 1.4%), 미상엽(CL, 8.1 ± 1.0%)^{1, 5}. 각 엽은 간동맥의 분지, 문맥의 분지 및 담관⁵을 포함하는 문맥 삼각체에 의해 공급된다. 역사적으로 LL과 ML을 절제하여 2/3 PH를 수행하기 위한 몇 가지 기술이 설명되었습니다. 여기에는 다음이 포함됩니다 : 1) 각 절제 된 엽의 기저부에서 단일 합자 en bloc으로 구성되는 고전적 기술; 2) 절제된 로브의 기저부에 적용된 티타늄 클립을 사용하는 지혈 클립 기술; 3) 클램프에 근접한 피어싱 봉합사를 사용하는 혈관 지향 실질 보존 기술; 4) 엽 절제술¹ 전에 문맥 및 간동맥 가지를 결찰하는 혈관 중심의 미세 수술 기법. 각 기술에는 상대적인 강점과 약점이 있지만 더 높은 치사율 ^1,8,9를 제공하는 기술은 없습니다.

이 연구에서는 마우스에서 78% PH를 확장하는 새로운 방법을 제시합니다. 이 모델에서는 LL, ML 및 RUL을 포함한 5개의 간엽 중 3개를 합자 기법을 사용하여 개별적으로 제거합니다(그림 1). 이 시술은 전체 간 종괴의 약 78%(77.2 ± 5.2%)를 절제합니다. 고전적인 PH 기법에서와 같이 "en bloc"이 아닌 LL과 ML을 별도로 제거하는 우리의 선택은 단일 합자가 대정맥¹에 너무 가깝게 적용될 때 나머지 엽의 괴사 위험 증가와 같은 이 두 엽의 엉뚱한 절제술과 관련된 합병증을 최소화합니다^. 10,11,12,13,14입니다. 이것은 RUL을 제거하기 위해 이 절차의 마지막 단계로 이동하기 전에 중요합니다. 8-12주 된 야생형 C57BL/6 마우스에 대한 이 광범위한 간절제술은 간 재생 실패로 인해 수술 후 1주일 이내에 50%의 치사율을 유발하여 전격성 간부전을 유발합니다^15,16. 78%의 확장된 간절제술 후 치사율이 증가한 이 마우스 모델은 소형 증후군의 병태생리학을 적절하게 요약하고 결과를 개선하기 위한 새로운 전략의 개발 및 테스트를 가능하게 합니다.

프로토콜

이 절차 프로토콜에 설명된 방법은 Beth Israel Deaconess Medical Center(BIDMC)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 IACUC 및 BIDMC 동물 연구 시설 지침에 따라 완료되었습니다.

1. 마우스 수술 전 준비

1. 클리퍼로 흉골 중앙에서 치골 상부까지 쥐의 복부를 면도합니다.
2. 100% 산소에 1-4% 이소플루란으로 전신 마취를 유도합니다. 마취가 끝나면 아래에 가열 패드를 놓고 수술 부위에 마우스를 누운 상태로 놓습니다. 절개하기 전에 발가락을 단단히 꼬집어 페달 반사가 없는지 확인하십시오(있는 경우 동물이 반응함). 전신 마취 상태를 얻기 위해 필요에 따라 마취 수준을 조정합니다.
   참고: 적절한 전신 마취를 유지하기 위해 필요에 따라 이소플루란을 적정하십시오.
3. 수술 후 진통을 위해 1.2mg/kg의 부프레노르핀 서방성(ER)을 피하로 투여합니다. 앞다리와 뒷다리를 펴고 쥐를 누운 상태로 놓고 팔다리를 테이프로 고정합니다. 그런 다음 수술을 위해 멸균 필드를 준비합니다.
   알림: 호흡이 방해받지 않도록 앞다리가 고정되었을 때 이완되어 있는지 확인하십시오.
4. 따뜻한 멸균 식염수와 베타딘 면봉으로 복부를 준비하고 각 면봉을 3번 번갈아 가며 사용합니다. 멸균 방식으로 복부를 드레이프합니다.

2. 간절제술

1. 메스를 사용하여 xiphoid process에서 suprapubic region까지 피부를 통해 수직 정중선 개복술을 만듭니다. 그런 다음 날카로운 가위로 선모를 절개하여 복막강으로 들어가 이 절개 부위를 피부 절개 부위 길이까지 확장합니다.
   참고: 장이 손상되지 않도록 먼저 간이 복벽까지 깊숙이 있는 복하 부위에서 linea alba를 절개하는 것이 더 안전합니다.
2. 적절한 견인기를 사용하여 복벽을 측면으로 후퇴시킵니다. 그런 다음 지혈제로 시푸스 돌기를 고정하고 흉골을 위쪽으로 수축시켜 간을 노출시킵니다.
3. 간을 아래쪽으로 수축시켜 팔시형 인대를 노출시킨 다음 날카로운 가위를 사용하여 간의 길이를 따라 인대를 절제합니다. 간을 흉부 쪽으로 우월하게 수축시켜 간위 인대와 간내 엽 인대를 노출시키고 날카로운 마이크로 가위를 사용하여 이러한 구조를 절제합니다.
   알림: 수축은 Glisson의 캡슐로 캡슐화된 간이 매우 약하고 멍이 들거나 찢어지기 쉽기 때문에 촉촉한 면 팁 어플리케이터를 사용하여 매우 부드럽게 수행해야 합니다.
4. 좌엽을 원래의 해부학적 위치에 유지하면서 정중엽을 우월하게 수축시킵니다. LL의 상부 내측 부분을 5-0 실크 봉합사로 감쌉니다. LL을 흉부 쪽으로 우월하게 반사시켜 엽의 아래쪽 표면을 노출시키고 봉합사 끝을 엽 기저부에서 모으고 기저부에서 봉합사를 묶습니다. LL을 결찰하기 위해 봉합사를 묶기 전에 봉합사가 하대정맥(IVC) 또는 문맥의 혈류를 방해하지 않는지 확인하십시오.
   참고: LL이 흉부 쪽으로 우월하게 반사되는 동안 이 봉합사를 묶어 결찰 중에 문맥 트라이어드가 잘 노출되도록 하는 것이 가장 좋습니다. 이것은 인접한 구조를 손상시키지 않고 기저부에 가까운 엽의 절제를 용이하게 합니다.
5. 날카로운 가위를 사용하여 봉합사 넥타이 바로 원위부에 있는 LL을 절제하고 작은 조직 커프(~2mm)가 절제된 엽의 가장자리에서 봉합사를 분리하는지 확인합니다. 지혈을 확인합니다.
6. 정중엽을 흉부 쪽으로 우월하게 반사하고 ML 기저부 주위에 5-0 실크 봉합사를 놓고 ML을 원래 해부학적 위치로 되돌립니다. ML의 상부 측면의 기저 위로 봉합사 끝을 근사화하고 로브의 기저부에 묶으십시오. 결찰된 ML을 절제하고 봉합사 넥타이 주위에 작은 남은 조직 커프를 남깁니다. 지혈을 확인합니다.
7. 간을 오른쪽에서 왼쪽으로 움직여 우측 상엽과 하엽을 노출시키고 이 엽을 내측과 하엽으로 조심스럽게 반사합니다. RUL의 상부 내측 측면에 5-0 봉합사를 감싸서 봉합사가 RUL 기저부를 둘러싸도록 한 다음 RUL을 흉부 쪽으로 반사합니다. RUL 아래에 봉합사를 감싸고 끝을 베이스에 가깝게 묶은 다음 절제하여 봉합사 넥타이 주위에 작은 남은 조직 커프를 남깁니다.
   참고: RUL의 기저부에 너무 근접하게 묶으면 RLL에 대한 혈액 공급이 손상되어 RLL의 허혈이 발생하고 수술 후 24시간 이내에 마우스가 죽을 수 있습니다. 반대로, RUL 기저부에서 너무 멀리 묶으면 간 종괴의 절제량이 감소하여 수술 후 생존율이 예상보다 높아집니다.
8. 남은 간을 해부학적 위치로 되돌리고 지혈을 확인합니다. 필요한 경우 절제된 간 가장자리에서 경미한 출혈이 있는 부위에 거즈로 압력을 가합니다.
9. 정중선 복벽(근막 및 근육층)을 5-0 폴리글락틴 봉합사를 사용하여 중단 없이 닫습니다. 스테이플 또는 5-0 모노필라멘트 봉합사로 피부 절개 부위를 봉합합니다.
10. 마취를 중단하고 쥐가 의식을 회복하고 정상적으로 걸을 수 있을 때까지 모니터링하십시오.

3. 수술 후 관리

1. 수술 후 쥐를 관찰하여 적절한 회복(즉, 쥐가 깨어 있고, 깨어 있고, 케이지 내에서 보행 상태)과 통증 조절을 확인합니다. 시술 후 2시간에서 6시간까지 마우스를 검사하고 그 후에는 매일 검사하십시오.
   알림: 수술 후 쥐가 케이지 내에서 더 느리게 움직일 것으로 예상됩니다. 생쥐는 다른 생쥐로부터 격리된 케이지에서 회복해야 하며 완전히 회복된 경우에만 다른 생쥐와 함께 있어야 합니다.
2. 마우스가 무감각한 체액이나 수술로 인한 과도한 출혈로 인해 저혈량증이 된 경우 따뜻한 생리식염수 주사(0.1-1.0mL, 피하 또는 복강내)를 투여합니다.

결과

78%의 장시간 간절제술이 성공적이라면 8-12주 된 건강한 성인 마우스에서 1주일 이내에 50%의 사망률을 유발할 것으로 예상된다¹⁶. 적절하게 시행하면 출혈을 최소화할 수 있습니다. 지속되는 잔류 출혈은 수동 압력으로 제어할 수 있습니다. 수술 후 24시간 이내에 수술 전후 사망하는 것은 종종 기술적 오류로 인해 발생합니다. 기술적 결함에는 난치성 수술 중 출혈을 유발하는 큰 ...

토론

생쥐에서 50%의 치사율을 유발하는 78%의 장시간 간절제술을 성공적으로 수행하기 위해서는 각 간엽을 정밀하게 절제하는 것이 중요합니다. 이러한 수준의 역량과 정밀도는 절차를 반복적으로 수행하는 경우에만 달성 할 수 있습니다. 교육 곡선은 작업자마다 다르지만 일반적으로 3-6개월의 연습이 필요합니다. TLM의 78% 미만을 제거하는 간 절제술은 생존율을 높이는 반면, TLM의 78% 이상을 제거하는...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x 2 Gauze	Covidien	2146	Surgery: dissection
5-O Nylon Monofilament Suture	Oasis	50-118-0631	Surgery: Skin closure
5-O Silk Suture	Fine Science Tools	18020-50	Surgery: liver lobe ligation
5-O Vicryl Suture	Ethicon	NC9335902	Surgery: Abdominal wall closure
Addson Forceps	Braintree Scientific	FC028	Surgery: dissection
Alcohol Swabs (2)	BD	326895	Disinfectant
Buprenorphine Extended Release Formulation	Zoopharm	N/A	Analgesia
Cordless Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868-14	Shaving
Curved Forceps	Braintree Scientific	FC0038	Surgery: dissection
Hemostat	Braintree Scientific	FC79-1	Surgery: dissection
Isoflurane Inhalant Anesthetic	Patterson Veterinary	RXISO-250	General Anesthesia
Magnet Fixator (2-slot) (2)	Braintree Scientific	ACD-001	Surgery: to hold small retractors
Magnet Fixator (4-slot)	Braintree Scientific	ACD-002	Surgery: to hold small retractors
Microscissors	Braintree Scientific	SC-MI 151	Surgery: dissection
Operating tray	Braintree Scientific	ACD-0014	Surgery: for establishment of surgical field
Povidone Iodine 10% Swabstick (2)	Medline	MDS093901ZZ	Disinfectant
Scalpel (15-blade)	Aspen Surgical Products	371615	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Curved)	Braintree Scientific	SC-T-406	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Straight)	Braintree Scientific	SC-T-405	Surgery: dissection
Small Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-118	Surgery: dissection
Tissue Forceps (Straight x2)	Braintree Scientific	FC1001	Surgery: dissection
Warming Pad (18" x 26")	Stryker	TP 700	Warming
Warming Pad Pump	Stryker	TP 700	Warming
Wire Handle Retractor (2)	Braintree Scientific	ACD-005	Surgery: to facilitate exposure of peritoneal cavity
Xenotec Isoflurane Small Animal Anesthesia System	Braintree Scientific	EZ-108SA	General Anesthesia: Contains Isoflurane vaborizer & console, Induction chamber, Regulator/Hose, Facemask (M)