Hepatectomía extendida al 78% en un modelo quirúrgico de ratón

Resumen

El modelo murino de hepatectomía parcial 2/3 (66%) está bien descrito en la literatura, pero rara vez se han utilizado hepatectomías más extendidas que imitan el síndrome de tamaño pequeño después del trasplante hepático. Describimos un procedimiento de hepatectomía extendida del 78% en un modelo de ratón que resulta en aproximadamente un 50% de letalidad postoperatoria en ratones sanos.

Resumen

La hepatectomía parcial 2/3 en ratones se utiliza en la investigación para estudiar la capacidad regenerativa del hígado y explorar los resultados de la resección hepática en varios modelos de enfermedad. En la hepatectomía parcial clásica 2/3 en ratones, dos de los cinco lóbulos hepáticos, a saber, el lóbulo izquierdo y el mediano, que representan aproximadamente el 66% de la masa hepática, se resecan en bloque con una supervivencia postoperatoria esperada del 100%. Las hepatectomías parciales más agresivas son técnicamente más desafiantes y, por lo tanto, rara vez se han utilizado en ratones. Nuestro grupo ha desarrollado un modelo de ratón de una técnica de hepatectomía extendida en la que tres de los cinco lóbulos hepáticos, incluidos los lóbulos izquierdo, mediano y superior derecho, se resecan por separado para eliminar aproximadamente el 78% de la masa hepática total. Esta resección prolongada, en ratones sanos, deja un hígado remanente que no siempre puede mantener una regeneración adecuada y oportuna. La falta de regeneración finalmente resulta en una letalidad postoperatoria del 50% dentro de 1 semana debido a la insuficiencia hepática fulminante. Este procedimiento de hepatectomía extendida al 78% en ratones representa un modelo quirúrgico único para el estudio del síndrome de tamaño pequeño y la evaluación de estrategias terapéuticas para mejorar la regeneración hepática y los resultados en el contexto del trasplante de hígado o la resección hepática extendida para el cáncer.

Introducción

Los modelos de resección hepática quirúrgica en ratones y ratas, descritos por primera vez en 1931, son los modelos experimentales más comunes utilizados para estudiar las bases moleculares de la regeneración hepática. También podrían ser útiles en la investigación científica traslacional para probar y desarrollar estrategias para mejorar los resultados después de la resección hepática prolongada o el trasplante de injertos hepáticos subóptimos 1,2,3,4. Las hepatectomías parciales (HP) en ratones implican la extirpación de aproximadamente 2/3 (66%) de la masa hepática total (TLM), que cuando se realizan en animales sanos tienen resultados excepcionales⁵. El procedimiento es de corta duración, fácilmente reproducible debido a la poca variación en la anatomía del hígado de ratón, y la supervivencia postoperatoria suele acercarse al 100%¹.

La hepatectomía parcial 2/3 que abarca la resección del lóbulo izquierdo (LL) y del lóbulo mediano (ML) permite que los lóbulos residuales se regeneren relativamente sin obstáculos por la inflamación lobar o la restricción del flujo de entrada y salida hepático. Más bien, el aumento del flujo venoso portal y, posteriormente, el estrés de cizallamiento en las células endoteliales sinusoidales del hígado después de la PH dan como resultado una regulación positiva sostenida de la expresión de óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) y la posterior liberación de óxido nítrico (NO), lo que contribuye a la preparación de los hepatocitos para la proliferación y la regeneración hepática³. Los resultados comúnmente estudiados después de 2/3 de PH en modelos de enfermedad como la enfermedad del hígado graso no alcohólico o en antecedentes genéticos específicos incluyen el riesgo de insuficiencia hepática aguda, medidas cualitativas y cuantitativas de la capacidad regenerativa del hígado y otras respuestas biológicas al estrés o lesiones traumáticas ^1,3.

Sin embargo, aún no se ha establecido un modelo de ratón que imite el síndrome funcional o anatómico de tamaño pequeño, tal como se produce después de una resección hepática prolongada por cáncer o un trasplante de injertos hepáticos marginales (esteatosis o tiempo isquémico prolongado) o parciales (divididos o de hígado de donante vivo). Para abordar esta necesidad, se requieren modelos de resecciones hepáticas más extensas que se extiendan más allá del mantenimiento de una masa hepática mínima (y funcional) para modelar el síndrome hepático de tamaño pequeño y el aumento de la mortalidad que se asocia con este síndrome ^6,7.

La anatomía del hígado de ratón exhibe una variación mínima. El hígado de ratón está compuesto por cinco lóbulos, cada uno de los cuales representa el siguiente porcentaje de la masa hepática total: lóbulo izquierdo (LL; 34,4 ± 1,9%), lóbulo mediano (ML; 26,2 ± 1,9%), lóbulo superior derecho (también llamado superior derecho) (RUL; 16,6 ± 1,4%), lóbulo inferior derecho (también llamado inferior derecho) (RLL; 14,7 ± 1,4%) y lóbulo caudado (CL, 8,1 ± 1,0%)^{1, 5}. Cada lóbulo está irrigado por una tríada portal, que incluye una rama de la arteria hepática, una rama de la vena porta y un conducto biliar⁵. Históricamente, se han descrito varias técnicas para realizar un PH de 2/3 mediante la resección de la LL y la ML. Entre ellas se encuentran: 1) la técnica clásica que consiste en una única ligadura en bloque en la base de cada uno de los lóbulos resecados; 2) la técnica de clip hemostático, utilizando clips de titanio aplicados en la base de los lóbulos resecados; 3) una técnica de preservación del parénquima orientado al vaso, que utiliza suturas perforantes proximales a la pinza; y 4) una técnica microquirúrgica orientada a los vasos, mediante la cual se ligan las ramas de la vena porta y la arteria hepática antes de la resección del lóbulo¹. Si bien cada técnica tiene fortalezas y debilidades relativas, ninguna produce una mayor letalidad ^1,8,9.

En este estudio, presentamos un método novedoso para el PH extendido del 78% en ratones. En este modelo, tres de los cinco lóbulos hepáticos, incluidos el LL, ML y RUL, se extirpan por separado mediante una técnica de ligadura (Figura 1). Este procedimiento da como resultado la resección de aproximadamente el 78% (77,2 ± 5,2%) de la masa hepática total. Nuestra elección de extirpar la LL y la ML por separado, y no "en bloque" como en la técnica clásica de la HP, minimiza las complicaciones asociadas a la resección en bloque de estos dos lóbulos, como la estenosis de la vena cava suprahepática y el aumento del riesgo de necrosis de los lóbulos restantes cuando la ligadura única se aplica demasiado cerca de la vena cava^1. 10,11,12,13,14. Esto es crucial antes de pasar al paso final de este procedimiento para eliminar el RUL. Esta hepatectomía extensa en ratones C57BL/6 de tipo salvaje de 8-12 semanas de edad causa una letalidad del 50% dentro de 1 semana de la cirugía debido a una regeneración hepática fallida que causa insuficiencia hepática fulminante^15,16. Este modelo de ratón de letalidad aumentada después de una hepatectomía prolongada del 78% recapitula adecuadamente la fisiopatología del síndrome de tamaño pequeño y permite el desarrollo y la prueba de estrategias novedosas para mejorar los resultados.

Protocolo

Los métodos descritos dentro de este protocolo de procedimiento han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro Médico Beth Israel Deaconess (BIDMC). Todos los experimentos se completaron de acuerdo y cumplimiento con las directrices de la IACUC y del centro de investigación animal del BIDMC.

1. Preparación preoperatoria en ratones

1. Afeita el abdomen del ratón desde la mitad del esternón hasta la región suprapúbica con una tijera.
2. Inducir anestesia general con isoflurano al 1-4% en oxígeno al 100%. Cuando esté anestesiado, coloque el ratón en decúbito supino sobre el campo quirúrgico con una almohadilla térmica debajo. Antes de hacer una incisión, pellizque firmemente el dedo del pie para asegurarse de que el reflejo del pedal esté ausente (si está presente, el animal responderá). Ajuste el nivel de anestesia según sea necesario para lograr un estado de anestesia general.
   NOTA: Titule el isoflurano según sea necesario para mantener una anestesia general adecuada.
3. Administrar 1,2 mg/kg de buprenorfina de liberación prolongada (RE) por vía subcutánea para la analgesia postoperatoria. Coloque al ratón en decúbito supino con las extremidades delanteras y traseras extendidas y asegure las extremidades con cinta adhesiva; Luego, prepare un campo estéril para la cirugía.
   NOTA: Asegúrese de que las extremidades delanteras estén relajadas cuando estén aseguradas para que no se obstaculice la respiración.
4. Prepare el abdomen con solución salina estéril tibia e hisopos betadine, alternando entre cada hisopo 3 veces. Cubre el abdomen de forma estéril.

2. Hepatectomía

1. Realice una incisión vertical de laparotomía en la línea media a través de la piel desde la apófisis xifoides hasta la región suprapúbica con un bisturí. A continuación, haga una incisión a través de la línea alba con unas tijeras afiladas para entrar en la cavidad peritoneal y extienda esta incisión a lo largo de la incisión en la piel.
   NOTA: Es más seguro incidir primero la línea alba en la región subxifoides donde el hígado está profundo hasta la pared abdominal para evitar lesiones en el intestino subyacente.
2. Retraer la pared abdominal lateralmente utilizando retractores adecuados; A continuación, pinza la apófisis xifoides con un hemostático y retrae el esternón superiormente para exponer el hígado.
3. Retraiga el hígado inferiormente para exponer el ligamento falciforme y luego, transece el ligamento a lo largo del hígado con tijeras afiladas. Retraiga el hígado superiormente hacia el tórax para exponer el ligamento hepatogástrico y los ligamentos del lóbulo intrahepático y seccione estas estructuras con microtijeras afiladas.
   NOTA: La retracción debe realizarse muy suavemente con aplicadores húmedos con punta de algodón, ya que el hígado, encapsulado por la cápsula de Glisson, es muy frágil y fácil de magullar y lacerar.
4. Retraiga el lóbulo mediano superiormente mientras mantiene el lóbulo izquierdo en su posición anatómica original. Envuelva una sutura de seda 5-0 alrededor de la parte superior medial de la LL. Refleje la LL superiormente hacia el tórax para exponer la superficie inferior del lóbulo, junte los extremos de la sutura en la base del lóbulo y ate la sutura en la base. Asegúrese de que la sutura no obstruya el flujo sanguíneo en la vena cava inferior (VCI) o en la vena porta antes de atar la sutura para ligar la LL.
   NOTA: Es mejor atar esta sutura mientras la LL se refleja superiormente hacia el tórax para que la tríada portal quede bien expuesta durante la ligadura. Esto facilita la resección del lóbulo cerca de la base sin comprometer las estructuras adyacentes.
5. Resecar la LL justo distal a la atadura de sutura con unas tijeras afiladas y asegurarse de que un pequeño manguito de tejido (~2 mm) separe la sutura del borde del lóbulo resecado. Confirmar la hemostasia.
6. Refleje el lóbulo mediano superiormente hacia el tórax, coloque una sutura de seda 5-0 alrededor de la base del ML y devuelva el ML a su posición anatómica original. Aproxime los extremos de la sutura sobre la base de la cara superior del ML y asegúrese de atarlos en la base del lóbulo. Resecar el ML ligado, dejando un pequeño manguito de tejido remanente alrededor de la atadura de sutura. Confirmar la hemostasia.
7. Movilice el hígado de derecha a izquierda para exponer los lóbulos superior e inferior derecho y refleje cuidadosamente estos lóbulos medial e inferiormente. Envuelva una sutura 5-0 sobre la cara medial superior del RUL para asegurarse de que la sutura rodee la base del RUL y luego, refleje el RUL hacia el tórax. Envuelva la sutura debajo de la RUL y ate los extremos cerca de su base, luego reseque, dejando un pequeño manguito de tejido remanente alrededor de la atadura de sutura.
   NOTA: El atado demasiado proximal en la base de la RUL puede comprometer el suministro de sangre a la RLL, lo que puede resultar en isquemia de la RLL y la muerte del ratón dentro de las 24 h posteriores a la operación. Por el contrario, la unión demasiado distal de la base RUL disminuye la cantidad de masa hepática resecada, lo que aumenta las tasas de supervivencia postoperatoria más allá de lo esperado.
8. Regrese el hígado restante a su posición anatómica en reposo y asegure la hemostasia. Si es necesario, aplique presión con gasa en las áreas de sangrado menor en los márgenes hepáticos resecados.
9. Cierre la pared abdominal de la línea media (fascia y capas musculares) con una sutura de poliglactina 5-0 de forma ininterrumpida. Cierre la incisión cutánea con grapas o suturas de monofilamento 5-0.
10. Suspenda la anestesia y controle al ratón hasta que recupere la conciencia y pueda deambular normalmente.

3. Cuidados postoperatorios

1. Observe al ratón en el postoperatorio para asegurar una recuperación adecuada (es decir, el ratón está despierto, alerta y deambulatorio dentro de la jaula) y el control del dolor. Examine al ratón cada 2 h hasta 6 h después del procedimiento, y luego diariamente.
   NOTA: Se espera que el ratón se mueva más lentamente dentro de la jaula después de la operación. El ratón debe recuperarse en una jaula aislada de otros ratones y solo debe volver a la compañía de otros ratones cuando esté completamente recuperado.
2. Administrar inyecciones de solución salina normal calentada (0,1-1,0 mL, subcutánea o intraperitoneal) si el ratón se vuelve hipovolémico debido a la insensibilidad al líquido o a la pérdida excesiva de sangre debido a la cirugía.

Resultados

Se espera que una hepatectomía extendida exitosa del 78% induzca una mortalidad del 50% en 1 semana en ratones adultos sanos de 8 a 12 semanas¹⁶. Cuando se realiza correctamente, se espera una pérdida mínima de sangre. El sangrado residual que persiste se puede controlar mediante presión manual. La muerte perioperatoria dentro de las 24 horas posteriores a la cirugía a menudo es causada por errores técnicos. Las fallas técnicas incluyen lesiones inadvertidas a grandes vasos sanguíneos que ...

Discusión

Para realizar con éxito una hepatectomía prolongada del 78% que causa una letalidad del 50% en ratones, es fundamental que cada lóbulo del hígado se reseque con precisión. Este nivel de competencia y precisión solo se puede lograr si el procedimiento se realiza repetidamente. La curva de entrenamiento varía entre los operadores, pero generalmente requiere de 3 a 6 meses de práctica. Una resección hepática en la que se extirpa menos del 78 % de la TLM daría lugar a tasas de supervivencia más altas, mientras qu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x 2 Gauze	Covidien	2146	Surgery: dissection
5-O Nylon Monofilament Suture	Oasis	50-118-0631	Surgery: Skin closure
5-O Silk Suture	Fine Science Tools	18020-50	Surgery: liver lobe ligation
5-O Vicryl Suture	Ethicon	NC9335902	Surgery: Abdominal wall closure
Addson Forceps	Braintree Scientific	FC028	Surgery: dissection
Alcohol Swabs (2)	BD	326895	Disinfectant
Buprenorphine Extended Release Formulation	Zoopharm	N/A	Analgesia
Cordless Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868-14	Shaving
Curved Forceps	Braintree Scientific	FC0038	Surgery: dissection
Hemostat	Braintree Scientific	FC79-1	Surgery: dissection
Isoflurane Inhalant Anesthetic	Patterson Veterinary	RXISO-250	General Anesthesia
Magnet Fixator (2-slot) (2)	Braintree Scientific	ACD-001	Surgery: to hold small retractors
Magnet Fixator (4-slot)	Braintree Scientific	ACD-002	Surgery: to hold small retractors
Microscissors	Braintree Scientific	SC-MI 151	Surgery: dissection
Operating tray	Braintree Scientific	ACD-0014	Surgery: for establishment of surgical field
Povidone Iodine 10% Swabstick (2)	Medline	MDS093901ZZ	Disinfectant
Scalpel (15-blade)	Aspen Surgical Products	371615	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Curved)	Braintree Scientific	SC-T-406	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Straight)	Braintree Scientific	SC-T-405	Surgery: dissection
Small Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-118	Surgery: dissection
Tissue Forceps (Straight x2)	Braintree Scientific	FC1001	Surgery: dissection
Warming Pad (18" x 26")	Stryker	TP 700	Warming
Warming Pad Pump	Stryker	TP 700	Warming
Wire Handle Retractor (2)	Braintree Scientific	ACD-005	Surgery: to facilitate exposure of peritoneal cavity
Xenotec Isoflurane Small Animal Anesthesia System	Braintree Scientific	EZ-108SA	General Anesthesia: Contains Isoflurane vaborizer & console, Induction chamber, Regulator/Hose, Facemask (M)