Epatectomia estesa al 78% in un modello chirurgico murino

Riepilogo

Il modello murino di epatectomia parziale 2/3 (66%) è ben descritto in letteratura, ma sono state raramente utilizzate epatectomie più estese che imitano la sindrome di piccole dimensioni dopo trapianto di fegato. Descriviamo una procedura di epatectomia estesa al 78% in un modello murino che si traduce in circa il 50% di letalità postoperatoria nei topi sani.

Abstract

L'epatectomia parziale 2/3 nei topi viene utilizzata nella ricerca per studiare la capacità rigenerativa del fegato ed esplorare gli esiti della resezione epatica in una serie di modelli di malattia. Nella classica epatectomia parziale 2/3 nei topi, due dei cinque lobi epatici, vale a dire i lobi sinistro e mediano che rappresentano circa il 66% della massa epatica, vengono resecati in blocco con una sopravvivenza postoperatoria attesa del 100%. Le epatectomie parziali più aggressive sono tecnicamente più impegnative e, quindi, sono state raramente utilizzate nei topi. Il nostro gruppo ha sviluppato un modello murino di una tecnica di epatectomia estesa in cui tre dei cinque lobi epatici, inclusi i lobi superiore sinistro, mediano e destro, vengono resecati separatamente per rimuovere circa il 78% della massa epatica totale. Questa resezione prolungata, in topi altrimenti sani, lascia un fegato residuo che non può sempre sostenere una rigenerazione adeguata e tempestiva. La mancata rigenerazione si traduce infine in una letalità postoperatoria del 50% entro 1 settimana a causa di insufficienza epatica fulminante. Questa procedura di epatectomia estesa al 78% nei topi rappresenta un modello chirurgico unico per lo studio della sindrome small-for-size e la valutazione di strategie terapeutiche per migliorare la rigenerazione epatica e gli esiti nel contesto del trapianto di fegato o della resezione epatica estesa per cancro.

Introduzione

I modelli di resezione epatica chirurgica su topi e ratti, descritti per la prima volta nel 1931, sono i modelli sperimentali più comuni utilizzati per studiare le basi molecolari della rigenerazione epatica. Potrebbero anche essere utili nella ricerca scientifica traslazionale per testare e sviluppare strategie per migliorare i risultati dopo una resezione epatica estesa o il trapianto di innesti epatici non ottimali 1,2,3,4. Le epatectomie parziali (PH) nei topi comportano la rimozione di circa 2/3 (66%) della massa epatica totale (TLM), che se eseguite in animali sani hanno esiti eccezionali⁵. La procedura è di breve durata, facilmente riproducibile a causa delle piccole variazioni nell'anatomia del fegato di topo e la sopravvivenza postoperatoria si avvicina tipicamente al 100%¹.

L'epatectomia parziale 2/3 che comprende la resezione del lobo sinistro (LL) e del lobo mediano (ML) consente ai lobi residui di rigenerarsi relativamente senza ostacoli da infiammazione lobare o restrizione dell'afflusso e del deflusso epatico. Piuttosto, l'aumento del flusso venoso portale e il conseguente stress di taglio sulle cellule endoteliali sinusoidali del fegato dopo la PH determinano una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endoteliale dell'ossido nitrico sintasi (eNOS) e il successivo rilascio di ossido nitrico (NO), che contribuiscono all'innesco degli epatociti per la proliferazione e la rigenerazione epatica³. Gli esiti comunemente studiati dopo 2/3 PH in modelli di malattia come la steatosi epatica non alcolica o in specifici background genetici includono il rischio di insufficienza epatica acuta, misure qualitative e quantitative della capacità rigenerativa del fegato e altre risposte biologiche allo stress o alle lesioni traumatiche ^1,3.

Tuttavia, un modello murino che imita la sindrome funzionale o anatomica di piccole dimensioni, come si verifica dopo una resezione epatica estesa per cancro o trapianto di innesti epatici marginali (steatosi o tempo ischemico prolungato) o parziali (split o da donatore vivente) innesti epatici, rimane da stabilire. Per rispondere a questa esigenza, sono necessari modelli di resezioni epatiche più estese che si estendono oltre il mantenimento di una massa epatica minima (e funzionale) per modellare la sindrome epatica di piccole dimensioni e l'aumento della mortalità associato a questa sindrome ^6,7.

L'anatomia del fegato di topo mostra variazioni minime. Il fegato del topo è composto da cinque lobi, ognuno dei quali rappresenta la seguente percentuale della massa epatica totale: lobo sinistro (LL; 34,4 ± 1,9%), lobo mediano (ML; 26,2 ± 1,9%), lobo superiore destro (chiamato anche superiore destro) (RUL; 16,6 ± 1,4%), lobo inferiore destro (chiamato anche inferiore destro) (RLL; 14,7 ± 1,4%) e lobo caudato (CL, 8,1 ± 1,0%)^{1, 5}. Ogni lobo è irrorato da una triade porta, che comprende un ramo dell'arteria epatica, un ramo della vena porta e un dotto biliare⁵. Storicamente, sono state descritte diverse tecniche per eseguire un PH 2/3 resecando il LL e il ML. Tra queste: 1) la tecnica classica che consiste in una singola legatura in blocco alla base di ciascuno dei lobi resecati; 2) la tecnica della clip emostatica, utilizzando clip in titanio applicate alla base dei lobi resecati; 3) una tecnica di conservazione del parenchima orientata verso i vasi, utilizzando suture perforanti prossimali al morsetto; e 4) una tecnica microchirurgica orientata ai vasi, in cui la vena porta e i rami dell'arteria epatica vengono legati prima della resezione del lobo¹. Sebbene ogni tecnica abbia punti di forza e di debolezza relativi, nessuna produce una letalità più elevata ^1,8,9.

In questo studio, presentiamo un nuovo metodo per estendere il 78% di PH nei topi. In questo modello, tre dei cinque lobi epatici, inclusi LL, ML e RUL, vengono rimossi separatamente utilizzando una tecnica di legatura (Figura 1). Questa procedura comporta la resezione di circa il 78% (77,2 ± 5,2%) della massa epatica totale. La nostra scelta di rimuovere LL e ML separatamente, e non "in blocco" come nella classica tecnica PH, riduce al minimo le complicanze associate alla resezione in blocco di questi due lobi, come la stenosi della vena cava sopraepatica e l'aumento del rischio di necrosi dei lobi rimanenti quando la singola legatura viene applicata troppo vicino alla vena cava^1, 10,11,12,13,14. Questo è fondamentale prima di passare alla fase finale di questa procedura per rimuovere la RUL. Questa epatectomia estesa in topi C57BL/6 wild-type di 8-12 settimane causa il 50% di letalità entro 1 settimana dall'intervento chirurgico a causa della mancata rigenerazione del fegato che causa insufficienza epatica fulminante^15,16. Questo modello murino di letalità aumentata dopo un'epatectomia estesa al 78% ricapitola in modo appropriato la fisiopatologia della sindrome di piccole dimensioni e consente lo sviluppo e la sperimentazione di nuove strategie per migliorare i risultati.

Protocollo

I metodi descritti all'interno di questo protocollo di procedura sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) presso il Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC). Tutti gli esperimenti sono stati completati in conformità con le linee guida IACUC e BIDMC della struttura di ricerca sugli animali.

1. Preparazione preoperatoria del topo

1. Radere l'addome del topo dalla metà dello sterno alla regione sovrapubica con un tagliaunghie.
2. Indurre l'anestesia generale con isoflurano all'1-4% in ossigeno al 100%. Una volta anestetizzato, posizionare il topo supino sul campo chirurgico con un termoforo sottostante. Prima di praticare un'incisione, pizzicare con decisione l'alluce per assicurarsi che il riflesso del pedale sia assente (se presente, l'animale risponderà). Regolare il livello di anestesia secondo necessità per raggiungere uno stato di anestesia generale.
   NOTA: Titolare l'isoflurano secondo necessità per mantenere un'adeguata anestesia generale.
3. Somministrare 1,2 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (ER) per via sottocutanea per l'analgesia postoperatoria. Posizionare il topo supino con gli arti anteriori e posteriori estesi e fissare gli arti con del nastro adesivo; Quindi, preparare un campo sterile per l'intervento chirurgico.
   NOTA: Assicurarsi che gli arti anteriori siano rilassati quando sono fissati in modo che la respirazione non sia ostacolata.
4. Preparare l'addome con tamponi salini sterili caldi e betadine, alternando ogni tampone 3 volte. Drappeggiare l'addome in modo sterile.

2. Epatectomia

1. Praticare un'incisione laparotomica verticale sulla linea mediana attraverso la pelle dal processo xifoideo alla regione sovrapubica usando un bisturi. Quindi, incidere attraverso la linea alba con forbici affilate per entrare nella cavità peritoneale ed estendere questa incisione fino alla lunghezza dell'incisione cutanea.
   NOTA: È più sicuro incidere prima la linea alba nella regione subxifoidea dove il fegato è profondo fino alla parete addominale per evitare lesioni all'intestino sottostante.
2. Ritrarre lateralmente la parete addominale utilizzando appositi divaricatori; Quindi, bloccare il processo xifoideo con un emostatico e ritrarre lo sterno superiormente per esporre il fegato.
3. Ritrarre il fegato inferiormente per esporre il legamento falciforme e quindi, sezionare il legamento lungo la lunghezza del fegato usando forbici affilate. Ritrarre il fegato superiormente verso il torace per esporre il legamento epatogastrico e i legamenti del lobo intraepatico e sezionare queste strutture utilizzando micro forbici affilate.
   NOTA: La retrazione deve essere eseguita molto delicatamente con applicatori umidi con punta di cotone poiché il fegato, incapsulato dalla capsula di Glisson, è molto fragile e facile da ammaccare e lacerare.
4. Ritrarre il lobo mediano superiormente mantenendo il lobo sinistro nella sua posizione anatomica originale. Avvolgere una sutura di seta 5-0 attorno alla parte superiore-mediale del LL. Riflettere il LL superiormente verso il torace per esporre la superficie inferiore del lobo, unire le estremità della sutura alla base del lobo e legare la sutura alla base. Assicurarsi che la sutura non ostruisca il flusso sanguigno nella vena cava inferiore (IVC) o nella vena porta prima di legare la sutura per legare il LL.
   NOTA: È meglio legare questa sutura mentre la LL viene riflessa superiormente verso il torace in modo che la triade portale sia ben esposta durante la legatura. Ciò facilita la resezione del lobo vicino alla base senza compromettere le strutture adiacenti.
5. Resecare l'LL appena distalmente al legante di sutura utilizzando forbici affilate e assicurarsi che una piccola cuffia di tessuto (~2 mm) separi la sutura dal bordo del lobo resecato. Confermare l'emostasi.
6. Riflettere il lobo mediano superiormente verso il torace, posizionare una sutura di seta 5-0 attorno alla base del ML e riportare il ML nella sua posizione anatomica originale. Approssimare le estremità della sutura alla base dell'aspetto superiore del ML e assicurarsi di legarle alla base del lobo. Resecare il ML legato, lasciando un piccolo bracciale di tessuto residuo attorno al laccio di sutura. Confermare l'emostasi.
7. Mobilizzare il fegato da destra a sinistra per esporre i lobi superiore e inferiore destro e riflettere attentamente questi lobi medialmente e inferiormente. Avvolgere una sutura 5-0 sull'aspetto superiore-mediale della RUL per assicurarsi che la sutura circondi la base RUL e quindi riflettere la RUL verso il torace. Avvolgere la sutura sotto il RUL e legare le estremità vicino alla sua base, quindi resecarla, lasciando un piccolo bracciale di tessuto residuo attorno al laccio della sutura.
   NOTA: Legare troppo prossimalmente alla base della RUL può compromettere l'afflusso di sangue alla RLL, che può provocare ischemia della RLL e morte del topo entro 24 ore dall'intervento. Al contrario, legando troppo distalmente dalla base RUL diminuisce la quantità di massa epatica resecata, aumentando così i tassi di sopravvivenza postoperatoria oltre quanto previsto.
8. Riportare il fegato rimanente nella sua posizione anatomica di riposo e garantire l'emostasi. Se necessario, applicare pressione con una garza sulle aree di sanguinamento minore ai margini del fegato resecati.
9. Chiudere la parete addominale della linea mediana (fascia e strati muscolari) utilizzando una sutura poliglactina 5-0 in modo ininterrotto. Chiudere l'incisione cutanea con graffette o suture monofilamento 5-0.
10. Interrompere l'anestesia e monitorare il topo fino a quando non riprende conoscenza e può deambulare normalmente.

3. Cure postoperatorie

1. Osservare il topo dopo l'intervento per garantire un recupero appropriato (cioè il topo è sveglio, vigile e deambulante all'interno della gabbia) e il controllo del dolore. Esaminare il mouse ogni 2 ore fino a 6 ore dopo la procedura, e poi ogni giorno.
   NOTA: Si prevede che il mouse si muova più lentamente all'interno della gabbia dopo l'intervento. Il topo dovrebbe riprendersi in una gabbia isolata dagli altri topi e tornare in compagnia di altri topi solo quando si è completamente ripreso.
2. Somministrare iniezioni di soluzione fisiologica normale riscaldata (0,1-1,0 ml, sottocutanee o intraperitoneali) se il topo diventa ipovolemico a causa di liquidi insensibili o di un'eccessiva perdita di sangue dovuta all'intervento chirurgico.

Risultati

Si prevede che un'epatectomia estesa al 78% di successo induca una mortalità del 50% entro 1 settimana in topi adulti sani di età compresa tra 8 e 12 settimane¹⁶. Se eseguita correttamente, ci si aspetta una perdita di sangue minima. Il sanguinamento residuo che persiste può essere controllato mediante pressione manuale. La morte perioperatoria entro 24 ore dall'intervento chirurgico è spesso causata da errori tecnici. I guasti tecnici includono lesioni involontarie ai grandi vasi sanguigni ch...

Discussione

Per eseguire con successo un'epatectomia estesa al 78% che causa una letalità del 50% nei topi, è fondamentale che ogni lobo del fegato sia resecato con precisione. Questo livello di competenza e precisione può essere raggiunto solo se la procedura viene eseguita ripetutamente. La curva di allenamento varia tra gli operatori, ma in genere richiede 3-6 mesi di pratica. Una resezione epatica che rimuove meno del 78% del TLM comporterebbe tassi di sopravvivenza più elevati, mentre una resezione epatica che rimuove più ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x 2 Gauze	Covidien	2146	Surgery: dissection
5-O Nylon Monofilament Suture	Oasis	50-118-0631	Surgery: Skin closure
5-O Silk Suture	Fine Science Tools	18020-50	Surgery: liver lobe ligation
5-O Vicryl Suture	Ethicon	NC9335902	Surgery: Abdominal wall closure
Addson Forceps	Braintree Scientific	FC028	Surgery: dissection
Alcohol Swabs (2)	BD	326895	Disinfectant
Buprenorphine Extended Release Formulation	Zoopharm	N/A	Analgesia
Cordless Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868-14	Shaving
Curved Forceps	Braintree Scientific	FC0038	Surgery: dissection
Hemostat	Braintree Scientific	FC79-1	Surgery: dissection
Isoflurane Inhalant Anesthetic	Patterson Veterinary	RXISO-250	General Anesthesia
Magnet Fixator (2-slot) (2)	Braintree Scientific	ACD-001	Surgery: to hold small retractors
Magnet Fixator (4-slot)	Braintree Scientific	ACD-002	Surgery: to hold small retractors
Microscissors	Braintree Scientific	SC-MI 151	Surgery: dissection
Operating tray	Braintree Scientific	ACD-0014	Surgery: for establishment of surgical field
Povidone Iodine 10% Swabstick (2)	Medline	MDS093901ZZ	Disinfectant
Scalpel (15-blade)	Aspen Surgical Products	371615	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Curved)	Braintree Scientific	SC-T-406	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Straight)	Braintree Scientific	SC-T-405	Surgery: dissection
Small Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-118	Surgery: dissection
Tissue Forceps (Straight x2)	Braintree Scientific	FC1001	Surgery: dissection
Warming Pad (18" x 26")	Stryker	TP 700	Warming
Warming Pad Pump	Stryker	TP 700	Warming
Wire Handle Retractor (2)	Braintree Scientific	ACD-005	Surgery: to facilitate exposure of peritoneal cavity
Xenotec Isoflurane Small Animal Anesthesia System	Braintree Scientific	EZ-108SA	General Anesthesia: Contains Isoflurane vaborizer & console, Induction chamber, Regulator/Hose, Facemask (M)