Hpatectomie prolongée à 78 % dans un modèle chirurgical de souris

Résumé

Le modèle murin d’hépatectomie partielle de 2/3 (66 %) est bien décrit dans la littérature, mais les hépatectomies plus étendues imitant le syndrome de petite taille après une transplantation hépatique ont rarement été utilisées. Nous décrivons une procédure d’hépatectomie prolongée à 78 % dans un modèle murin qui entraîne une létalité postopératoire d’environ 50 % chez des souris saines.

Résumé

L’hépatectomie partielle 2/3 chez la souris est utilisée dans la recherche pour étudier la capacité de régénération du foie et explorer les résultats de la résection hépatique dans un certain nombre de modèles de maladies. Dans l’hépatectomie partielle classique 2/3 chez la souris, deux des cinq lobes hépatiques, à savoir les lobes gauche et médian représentant environ 66% de la masse hépatique, sont réséqués en bloc avec une survie postopératoire attendue de 100%. Les hépatectomies partielles plus agressives sont techniquement plus difficiles et, par conséquent, ont rarement été utilisées chez la souris. Notre groupe a mis au point un modèle murin d’une technique d’hépatectomie étendue dans laquelle trois des cinq lobes du foie, y compris les lobes supérieurs gauche, médian et droit, sont réséqués séparément pour éliminer environ 78 % de la masse hépatique totale. Cette résection prolongée, chez des souris par ailleurs en bonne santé, laisse un reste de foie qui ne peut pas toujours maintenir une régénération adéquate et opportune. L’incapacité à se régénérer entraîne finalement une létalité postopératoire de 50 % en 1 semaine en raison d’une insuffisance hépatique fulminante. Cette procédure d’hépatectomie étendue à 78 % chez la souris représente un modèle chirurgical unique pour l’étude du syndrome de petite taille et l’évaluation de stratégies thérapeutiques visant à améliorer la régénération hépatique et les résultats dans le cadre d’une transplantation hépatique ou d’une résection hépatique étendue pour le cancer.

Introduction

Les modèles de résection chirurgicale du foie chez la souris et le rat, décrits pour la première fois en 1931, sont les modèles expérimentaux les plus couramment utilisés pour étudier les bases moléculaires de la régénération du foie. Ils pourraient également être utiles dans la recherche scientifique translationnelle pour tester et développer des stratégies visant à améliorer les résultats après une résection hépatique prolongée ou une transplantation de greffons hépatiques sous-optimaux 1,2,3,4. Les hépatectomies partielles (HTP) chez la souris impliquent l’ablation d’environ 2/3 (66 %) de la masse hépatique totale (TLM), ce qui, lorsqu’il est pratiqué chez des animaux en bonne santé, a des résultats exceptionnels⁵. La procédure est de courte durée, facilement reproductible en raison de la faible variation de l’anatomie du foie de la souris, et la survie postopératoire approche généralement les 100 %¹.

L’hépatectomie partielle 2/3 englobant la résection du lobe gauche (LL) et du lobe médian (ML) permet aux lobes résiduels de se régénérer relativement sans entrave par l’inflammation lobaire ou la restriction de l’entrée et de la sortie hépatiques. Au contraire, l’augmentation du débit veineux porte et le stress de cisaillement ultérieur sur les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques après l’HTP entraînent une régulation à la hausse soutenue de l’expression de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) et la libération ultérieure d’oxyde nitrique (NO), qui contribuent à l’amorçage des hépatocytes pour la prolifération et la régénération hépatique³. Les critères de jugement couramment étudiés après une HTP 2/3 dans des modèles de maladies tels que la stéatose hépatique non alcoolique ou dans des contextes génétiques spécifiques comprennent le risque d’insuffisance hépatique aiguë, les mesures qualitatives et quantitatives de la capacité de régénération du foie et d’autres réponses biologiques au stress ou aux lésions traumatiques ^1,3.

Cependant, un modèle murin imitant le syndrome fonctionnel ou anatomique de petite taille, tel qu’il se produit à la suite d’une résection hépatique prolongée pour un cancer ou d’une transplantation de greffes hépatiques marginales (stéatose ou temps ischémique prolongé) ou partielles (fractionnées ou provenant de foie de donneurs vivants), reste à établir. Pour répondre à ce besoin, des modèles de résections hépatiques plus étendues qui vont au-delà du maintien d’une masse hépatique minimale (et fonctionnelle) sont nécessaires pour modéliser le syndrome du foie de petite taille et la mortalité accrue associée à ce syndrome ^6,7.

L’anatomie du foie de souris présente des variations minimes. Le foie de souris est composé de cinq lobes, chacun représentant le pourcentage suivant de la masse hépatique totale : lobe gauche (LL ; 34,4 ± 1,9 %), lobe médian (ML ; 26,2 ± 1,9 %), lobe supérieur droit (également appelé supérieur droit) (RUL ; 16,6 ± 1,4 %), lobe inférieur droit (également appelé inférieur droit) (RLL ; 14,7 ± 1,4 %) et lobe caudé (CL, 8,1 ± 1,0 %^{)1, 5}. Aéroport Chaque lobe est alimenté par une triade porte, comprenant une branche de l’artère hépatique, une branche de la veine porte et un canal biliaire⁵. Historiquement, plusieurs techniques ont été décrites pour réaliser une PH 2/3 en réséquant le LL et le ML. Il s’agit notamment de 1) la technique classique qui consiste en une seule ligature en bloc à la base de chacun des lobes réséqués ; 2) la technique du clip hémostatique, à l’aide de clips en titane appliqués à la base des lobes réséqués ; 3) une technique de préservation du parenchyme orientée vers les vaisseaux, à l’aide de sutures de piercing proximales à la pince ; et 4) une technique microchirurgicale orientée vers les vaisseaux, où la veine porte et les branches de l’artère hépatique sont ligaturées avant la résection du lobe¹. Bien que chaque technique ait des forces et des faiblesses relatives, aucune ne donne une létalité plus élevée ^1,8,9.

Dans cette étude, nous présentons une nouvelle méthode pour un PH prolongé de 78 % chez la souris. Dans ce modèle, trois des cinq lobes du foie, y compris le LL, le ML et le RUL, sont retirés séparément à l’aide d’une technique de ligature (Figure 1). Cette procédure entraîne la résection d’environ 78 % (77,2 ± 5,2 %) de la masse hépatique totale. Notre choix d’enlever le LL et le ML séparément, et non « en bloc » comme dans la technique classique de la PH, minimise les complications associées à la résection en bloc de ces deux lobes, telles que la sténose de la veine cave suprahépatique et le risque accru de nécrose des lobes restants lorsque la ligature unique est appliquée trop près de la veine cave^1, 10,11,12,13,14. Ceci est crucial avant de passer à l’étape finale de cette procédure de retrait de la RUL. Cette hépatectomie extensive chez des souris C57BL/6 de type sauvage âgées de 8 à 12 semaines provoque une létalité de 50% dans la semaine suivant la chirurgie en raison d’un échec de la régénération hépatique provoquant une insuffisance hépatique fulminante^15,16. Ce modèle murin de létalité accrue après une hépatectomie prolongée à 78 % récapitule de manière appropriée la physiopathologie du syndrome de petite taille et permet le développement et la mise à l’essai de nouvelles stratégies pour améliorer les résultats.

Protocole

Les méthodes décrites dans ce protocole de procédure ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives de l’IACUC et de l’installation de recherche animale BIDMC.

1. Préparation préopératoire chez la souris

1. Rasez l’abdomen de la souris du milieu du sternum à la région sus-pubienne avec une tondeuse.
2. Induire une anesthésie générale avec 1-4% d’isoflurane dans 100% d’oxygène. Une fois anesthésiée, placez la souris en décubitus dorsal sur le champ opératoire avec un coussin chauffant en dessous. Avant de faire une incision, pincez fermement l’orteil pour vous assurer que le réflexe de pédale est absent (s’il est présent, l’animal répondra). Ajustez le niveau d’anesthésie au besoin pour obtenir un état d’anesthésie générale.
   REMARQUE : Titrez l’isoflurane au besoin pour maintenir une anesthésie générale adéquate.
3. Administrer 1,2 mg/kg de buprénorphine à libération prolongée (RE) par voie sous-cutanée pour l’analgésie postopératoire. Placez la souris en décubitus dorsal avec les membres antérieurs et les pattes arrière étendus et fixez les membres avec du ruban adhésif ; Ensuite, préparez un champ stérile pour la chirurgie.
   REMARQUE : Assurez-vous que les membres antérieurs sont détendus lorsqu’ils sont sécurisés afin de ne pas entraver la respiration.
4. Préparez l’abdomen avec des tampons de solution saline et de bétadine stériles chauds, en alternant 3 fois entre chaque écouvillon. Drapez l’abdomen de manière stérile.

2. Hépatectomie

1. Faites une incision verticale de laparotomie médiane à travers la peau de l’apophyse xiphoïde à la région sus-pubienne à l’aide d’un scalpel. Ensuite, incisez à travers la linea alba avec des ciseaux tranchants pour pénétrer dans la cavité péritonéale et étendez cette incision à la longueur de l’incision cutanée.
   REMARQUE : Il est plus sûr d’inciser d’abord la linea alba dans la région subxiphoïde où le foie est profond par rapport à la paroi abdominale pour éviter de blesser l’intestin sous-jacent.
2. Rétracter la paroi abdominale latéralement à l’aide d’écarteurs appropriés ; Ensuite, clampez l’apophyse xiphoïde avec un hémostat et rétractez le sternum vers le haut pour exposer le foie.
3. Rétractez le foie vers le bas pour exposer le ligament falciforme, puis transectez le ligament sur toute la longueur du foie à l’aide de ciseaux tranchants. Rétracter le foie vers le haut vers le thorax pour exposer le ligament hépatogastrique et les ligaments du lobe intrahépatique et transecter ces structures à l’aide de micro-ciseaux tranchants.
   REMARQUE : La rétraction doit être effectuée très doucement avec des applicateurs à embout de coton humide car le foie, encapsulé par la capsule de Glisson, est très fragile et facile à meurtrir et à lacérer.
4. Rétractez le lobe médian vers le haut tout en gardant le lobe gauche dans sa position anatomique d’origine. Enroulez une suture en soie 5-0 autour de la partie médiale supérieure de la LL. Réfléchissez la LL vers le haut vers le thorax pour exposer la surface inférieure du lobe, rassemblez les extrémités de la suture à la base du lobe et attachez la suture à la base. Assurez-vous que la suture n’obstrue pas la circulation sanguine dans la veine cave inférieure (VCI) ou la veine porte avant de ligaturer la suture pour ligaturer la LL.
   REMARQUE : Il est préférable de faire cette suture pendant que la LL est réfléchie vers le thorax afin que la triade porte soit bien exposée pendant la ligature. Cela facilite la résection du lobe près de la base sans compromettre les structures adjacentes.
5. Réséquez le LL juste distal à l’attache de suture à l’aide de ciseaux tranchants et assurez-vous qu’un petit brassard de tissu (~2 mm) sépare la suture du bord du lobe réséqué. Confirmez l’hémostase.
6. Réfléchissez le lobe médian vers le haut vers le thorax, placez une suture en soie 5-0 autour de la base du ML et ramenez le ML à sa position anatomique d’origine. Approchez les extrémités de la suture sur la base de la face supérieure du ML et assurez-vous de les attacher à la base du lobe. Réséquez le ML ligaturé, en laissant une petite manchette de tissu restant autour du lien de suture. Confirmez l’hémostase.
7. Mobilisez le foie de droite à gauche pour exposer les lobes supérieur et inférieur droit et réfléchissez soigneusement ces lobes médialement et inférieurement. Enroulez une suture 5-0 sur la face médiale supérieure de la RUL pour vous assurer que la suture entoure la base de la RUL, puis réfléchissez la RUL vers le thorax. Enroulez la suture sous la RUL et attachez les extrémités près de sa base, puis réséquez-la en laissant une petite manchette de tissu restant autour de l’attache de suture.
   REMARQUE : Un attachement trop proximal à la base de la RUL peut compromettre l’apport sanguin à la RLL, ce qui peut entraîner une ischémie de la RLL et la mort de la souris dans les 24 heures suivant l’opération. En revanche, le fait de se lier trop distalement à partir de la base RUL diminue la quantité de masse hépatique réséquée, augmentant ainsi les taux de survie postopératoire au-delà de ce qui est attendu.
8. Remettez le foie restant dans sa position anatomique de repos et assurez-vous de l’hémostase. Si nécessaire, appliquez une pression avec de la gaze sur les zones de saignement mineur aux marges hépatiques réséquées.
9. Fermez la paroi abdominale médiane (fascia et couches musculaires) à l’aide d’une suture polyglacine 5-0 de manière ininterrompue. Fermez l’incision cutanée avec des agrafes ou des sutures monofilament 5-0.
10. Arrêtez l’anesthésie et surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience et puisse se déplacer normalement.

3. Soins postopératoires

1. Observez la souris après l’opération pour assurer une récupération appropriée (c’est-à-dire que la souris est éveillée, alerte et ambulatoire dans la cage) et le contrôle de la douleur. Examinez la souris toutes les 2 h jusqu’à 6 h après l’intervention, puis tous les jours.
   REMARQUE : On s’attend à ce que la souris se déplace plus lentement dans la cage après l’opération. La souris doit se rétablir dans une cage isolée des autres souris et ne retourner en compagnie d’autres souris que lorsqu’elle est complètement rétablie.
2. Administrer des injections de solution saline normales réchauffées (0,1 à 1,0 ml, sous-cutanées ou intrapéritonéales) si la souris devient hypovolémique à cause d’un liquide insensible ou d’une perte de sang excessive due à la chirurgie.

Résultats

Une hépatectomie prolongée réussie à 78 % devrait induire une mortalité de 50 % en 1 semaine chez des souris adultes en bonne santé âgées de 8 à 12 semaines¹⁶. Lorsqu’il est correctement effectué, une perte de sang minimale est attendue. Les saignements résiduels qui persistent peuvent être contrôlés par une pression manuelle. La mort périopératoire dans les 24 heures suivant la chirurgie est souvent causée par des erreurs techniques. Les défaillances techniques comprennent des...

Discussion

Pour réaliser avec succès une hépatectomie prolongée à 78 % entraînant une létalité de 50 % chez la souris, il est essentiel que chaque lobe du foie soit réséqué avec précision. Ce niveau de compétence et de précision ne peut être atteint que si la procédure est effectuée de manière répétée. La courbe de formation varie d’un opérateur à l’autre, mais nécessite généralement 3 à 6 mois de pratique. Une résection hépatique qui enlève moins de 78 % du TLM entraînerait des taux de survie plu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x 2 Gauze	Covidien	2146	Surgery: dissection
5-O Nylon Monofilament Suture	Oasis	50-118-0631	Surgery: Skin closure
5-O Silk Suture	Fine Science Tools	18020-50	Surgery: liver lobe ligation
5-O Vicryl Suture	Ethicon	NC9335902	Surgery: Abdominal wall closure
Addson Forceps	Braintree Scientific	FC028	Surgery: dissection
Alcohol Swabs (2)	BD	326895	Disinfectant
Buprenorphine Extended Release Formulation	Zoopharm	N/A	Analgesia
Cordless Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868-14	Shaving
Curved Forceps	Braintree Scientific	FC0038	Surgery: dissection
Hemostat	Braintree Scientific	FC79-1	Surgery: dissection
Isoflurane Inhalant Anesthetic	Patterson Veterinary	RXISO-250	General Anesthesia
Magnet Fixator (2-slot) (2)	Braintree Scientific	ACD-001	Surgery: to hold small retractors
Magnet Fixator (4-slot)	Braintree Scientific	ACD-002	Surgery: to hold small retractors
Microscissors	Braintree Scientific	SC-MI 151	Surgery: dissection
Operating tray	Braintree Scientific	ACD-0014	Surgery: for establishment of surgical field
Povidone Iodine 10% Swabstick (2)	Medline	MDS093901ZZ	Disinfectant
Scalpel (15-blade)	Aspen Surgical Products	371615	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Curved)	Braintree Scientific	SC-T-406	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Straight)	Braintree Scientific	SC-T-405	Surgery: dissection
Small Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-118	Surgery: dissection
Tissue Forceps (Straight x2)	Braintree Scientific	FC1001	Surgery: dissection
Warming Pad (18" x 26")	Stryker	TP 700	Warming
Warming Pad Pump	Stryker	TP 700	Warming
Wire Handle Retractor (2)	Braintree Scientific	ACD-005	Surgery: to facilitate exposure of peritoneal cavity
Xenotec Isoflurane Small Animal Anesthesia System	Braintree Scientific	EZ-108SA	General Anesthesia: Contains Isoflurane vaborizer & console, Induction chamber, Regulator/Hose, Facemask (M)