从人脂肪来源的间充质干细胞中纯化和表征细胞外囊泡

摘要

该方案描述了所有程序，从培养人脂肪来源的间充质干细胞 （ADSC） 和收集上清液到使用超速离心提取细胞外囊泡 （EV）。

摘要

人脂肪来源的间充质干细胞 （ADSC） 可以促进各种组织和器官的再生和重建。最近的研究表明，它们的再生功能可能归因于细胞间接触和细胞旁分泌效应。旁分泌效应是细胞在短距离内相互作用和传递信息的重要方式，其中细胞外囊泡 （EV） 作为载体发挥着功能作用。ADSC EV 在再生医学中具有巨大潜力。多项研究报告了这些方法的有效性。目前根据离心、沉淀、分子大小、亲和力和微流体等原理描述了提取和分离 EV 的各种方法。超速离心法被认为是分离 EV 的金标准。尽管如此，仍然缺乏强调超速离心过程中预防措施的细致方案。本研究介绍了 ADSC 培养、上清液收集和 EV 超速离心所涉及的方法和关键步骤。然而，尽管超速离心具有成本效益并且不需要进一步处理，但仍存在一些不可避免的缺点，例如回收率低和 EV 聚集。

引言

大多数 ADSC 来源于脂肪组织，并已被证明可促进各种组织和器官的再生和重建，包括心肌、骨骼和皮肤¹。最近的研究表明，ADSC 的再生功能可能是由于细胞间接触和细胞旁分泌作用²。旁分泌效应是细胞在短距离内相互作用和传递信息的重要手段，这一功能是通过细胞外囊泡 （EV） 实现的。

EV 是由细胞产生的双层膜结构，直径范围为 40 nm 至 160 nm（平均约为 100 nm）。它们影响不同的细胞功能，例如细胞因子产生、细胞增殖、细胞凋亡和代谢 ^3,4。已经对 ADSC EV 的功能进行了大量研究，包括促进骨再生、口腔粘膜组织再生、组织移植后脂肪组织存活和皮肤伤口修复 5,6,7,8。ADSC EV 在再生医学中的巨大潜力是显而易见的。从上清液中提取和分离 EV 的方法多种多样，例如基于离心、沉淀、分子大小、亲和力和微流体的技术。超速离心法被广泛认为是分离 EV 的金标准⁹

研究方案

协议步骤的概述如图 1 所示。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 培养基制备

1. 使用 450 mL 基础培养基、50 mL 不含外泌体的胎牛血清和 5 mL 三联抗生素制备不含外泌体的 ADSC 培养基。

2. ADSC 的复苏和培养

注意：复苏 ADSC。

1. 事先打开超净台的紫外线辐射并消毒 30 分钟。
2. 事先在 37 °C 水浴中预热培养基。
3. 从液氮中检索 2 管冷冻的 ADSC （P3），并在 37 °C 恒温水浴中搅拌直至完全解冻。
   注意： 冷冻管的开口不应与水接触，以防止污染。
4. 使用 75% 酒精对冻存管进行消毒，然后将其移至超净台上。使用移液管吸出细胞悬液，并将其放入 15 mL 离心管中。
5. 将离心管放入低速离心机中，并在 4 °C 下以 250 x g 离心 5 分钟。
6. 准备四个 10 cm 培养皿，并将 9 mL 培养基放入每个培养皿中。标记名称、细胞类型、世代和实验日期，然后在 37 °C 恒温细胞....

讨论

在正式的实验过程中，有几点对于获得最佳实验结果至关重要。根据我们以前的经验，建议选择第 3-6 代 ADSC，因为它们可以确保最佳的细胞状态。在 P3 之前，红细胞、内皮细胞和其他杂细胞可能没有被筛选出来。P6 之后，细胞可能会逐渐老化，这会影响分泌的 EV 的状态。其次，当细胞汇合度在 80% 和 90% 之间时，必须收集上清液，以确保尽可能多地分泌 EV。为了保持 EV 的最大纯度，研究人员在?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture	OriCell	BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)	OriCell	HUXMD-05002
Inverted Microscope	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)	Solarbio	P1410