İnsan Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Özet

Bu protokol, insan yağ kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (ADSC'ler) kültürlenmesinden ve süpernatantın toplanmasından ultrasantrifüjleme kullanılarak hücre dışı veziküllerin (EV'ler) çıkarılmasına kadar tüm prosedürleri açıklar.

Özet

İnsan yağ kaynaklı mezenkimal kök hücreler (ADSC'ler), çeşitli doku ve organların yenilenmesini ve yeniden yapılandırılmasını teşvik edebilir. Son araştırmalar, rejeneratif işlevlerinin hücre-hücre temasına ve hücre parakrin etkilerine atfedilebileceğini düşündürmektedir. Parakrin etkisi, hücrelerin, hücre dışı veziküllerin (EV'ler) taşıyıcı olarak işlevsel bir rol oynadığı kısa mesafelerde etkileşime girmesi ve bilgi aktarması için önemli bir yoldur. Rejeneratif tıpta ADSC EV'ler için önemli bir potansiyel vardır. Bu yöntemlerin etkinliği hakkında çok sayıda çalışma bildirilmiştir. EV'lerin çıkarılması ve izole edilmesi için çeşitli yöntemler şu anda santrifüjleme, çökeltme, moleküler boyut, afinite ve mikroakışkanlar gibi ilkelere dayalı olarak tanımlanmaktadır. Ultrasantrifüjleme, EV'leri izole etmek için altın standart olarak kabul edilir. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme sırasında alınacak önlemleri vurgulamak için titiz bir protokol hala mevcut değildir. Bu çalışma, ADSC kültürü, süpernatan toplama ve EV ultrasantrifüjlemesinde yer alan metodolojiyi ve önemli adımları sunmaktadır. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme uygun maliyetli olmasına ve daha fazla tedavi gerektirmemesine rağmen, düşük geri kazanım oranı ve EV agregasyonu gibi bazı kaçınılmaz dezavantajlar vardır.

Giriş

Çoğu ADSC yağ dokusundan türetilir ve miyokard, kemik ve deri¹ dahil olmak üzere çeşitli doku ve organların rejenerasyonunu ve yeniden inşasını teşvik ettiği gösterilmiştir. Son araştırmalar, ADSC'lerin rejeneratif fonksiyonunun hücreler arası temasa ve hücrelerin parakrin etkilerine bağlı olabileceğini düşündürmektedir². Parakrin etkisi, hücrelerin kısa mesafelerde etkileşime girmesi ve bilgi aktarması için önemli bir araçtır ve bu işlev, hücre dışı veziküller (EV'ler) aracılığıyla sağlanır.

EV'ler, hücreler tarafından üretilen, çapı 40 nm ila 160 nm arasında değişen (ortalama yaklaşık 100 nm ile) çift katmanlı zar yapılarıdır. Sitokin üretimi, hücre proliferasyonu, apoptoz ve metabolizma gibi farklı hücresel fonksiyonları etkilerler ^3,4. Kemik rejenerasyonunun teşvik edilmesi, oral mukozal doku rejenerasyonu, doku nakli sonrası yağ dokusu sağkalımı ve cilt yara onarımı dahil olmak üzere ADSC EV'lerin işlevleri üzerine çok sayıda çalışma yapılmıştır 5,6,7,8. ADSC EV'lerin rejeneratif tıptaki muazzam potansiyeli açıktır. EV'leri süpernatanttan çıkarmak ve ayırmak için santrifüjleme, çökeltme, moleküler büyüklük, afinite ve mikroakışkanlara dayalı teknikler gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Ultrasantrifüjleme yöntemi, EV'leri izole etmek için yaygın olarak altın standart olarak kabul edilir⁹. EV ayırma için ultrasantrifüjlemenin temel prensibi, numunedeki partiküllerin değişen sedimantasyon katsayılarına sahip olması ve bunun sonucunda bunların farklı ayırma katmanlarında sedimantasyon ve agregasyon ile sonuçlanması gerçeğine dayanmaktadır. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme sırasında önlemleri vurgulayan ayrıntılı bir protokol henüz oluşturulmamıştır.

Bu nedenle, bu çalışma, ADSC kültürünü, süpernatant koleksiyonunu ve EV'lerin ultrasantrifüj prosedürlerini ve kilit noktalarını mantıklı bir bilgi akışı ve açık, resmi bir dille objektif bir şekilde özetlemektedir. Bu, gelecekteki deneyler için değerli bir referans sağlar.

Protokol

Protokol adımlarına genel bakış Şekil 1'de gösterilmektedir. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Medya hazırlığı

1. 450 mL bazal kültür ortamı, 50 mL eksozomsuz fetal sığır serumu ve 5 mL üçlü antibiyotik kullanarak eksozomsuz ADSC için bir kültür ortamı hazırlayın.

2. ADSC'lerin canlandırılması ve kültürlenmesi

NOT: ADSC'leri yeniden canlandırın.

1. Ultra temiz masanın UV radyasyonunu önceden açın ve 30 dakika dezenfekte edin.
2. Ortamı önceden 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın.
3. Sıvı nitrojenden 2 tüp donmuş ADSC (P3) alın ve tamamen çözülene kadar 37 ° C'lik bir su banyosunda sabit sıcaklıkta çalkalayın.
   NOT: Kontaminasyonu önlemek için dondurucu borusunun açıklığı su ile temas etmemelidir.
4. Kriyoprezervasyon tüpünü %75 alkol kullanarak dezenfekte edin ve ardından ultra temiz masaya taşıyın. Hücre süspansiyonunu bir pipet kullanarak aspire edin ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
5. Santrifüj tüpünü düşük hızlı bir santrifüj makinesine yerleştirin ve 250 x g'da 5 °C'de 4 dakika santrifüjleyin.
6. Dört adet 10 cm'lik kültür kabı hazırlayın ve her tabağa 9 mL orta boy koyun. Adını, hücre tipini, üretimini ve deney tarihini işaretleyin ve ardından bunları 37 °C termostatik hücre inkübatörde önceden ısıtın.
7. Santrifüj tüpünü dezenfekte edin ve ultra temiz masaya taşıyın. Süpernatanı bir pipetle çıkarın.
8. 4 mL ortam ekleyin ve çözeltiyi (1 x 10⁵ hücre / mL) eşit şekilde dağılana kadar hafifçe çalkalayın.
   NOT: Süpernatanı çıkarırken hücre peletini ortadan kaldırmamaya dikkat edin.
9. Her yemeğe 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Bulaşıkları çapraz yöntemle çalkalayın.
   NOT: Plakayı düz bir yüzeye yerleştirin ve 5-6 tekrar için çapraz bir düzende (yukarı, aşağı, sola ve sağa hareket ettirerek) çalkalayın. Merkezde hücre birikimine neden olabileceğinden dairesel hareketlerden kaçının.
10. Optik mikroskopla hücreleri 40x büyütmede gözlemleyin ve ardından bulaşıkları inkübatöre yerleştirin.
    NOT: Hücreleri gözlemlemenin birincil amacı, eşit olmayan dağılım sonraki büyümeyi etkileyeceğinden, eşit dağılıp dağılmadıklarını belirlemektir.
11. Hücreler için değişim ortamı hazırlayın.
    1. Ultra temiz masanın UV radyasyonunu önceden açın ve 30 dakika dezenfekte edin.
    2. Ortamı önceden 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın.
    3. Optik mikroskop altında 40x büyütmede hücre durumunu gözlemleyin. Birleşme seviyesi yaklaşık% 50'dir.
       NOT: Birleşme seviyesi, hücreler duvara yapıştıktan ve tamamen gerildikten sonra hücrelerin kapladığı alanın petri kabının yüzey alanına oranı olarak hesaplanır.
    4. Dezenfeksiyondan sonra kültür kabını ultra temiz masaya (Biyogüvenlik seviyesi 2) aktarın ve ortamı çıkarın.
    5. Her kültür kabını 2 mL PBS çözeltisi ile iki kez nazikçe durulayın.
    6. Her yemeğe 10 mL orta boy ekleyin. Bulaşıkları kuluçka makinesine aktarın.

3. Süpernatan ADSC'lerin toplanması ve EV'lerin çıkarılması

1. Ultra temiz masanın UV radyasyonunu önceden açın ve 30 dakika dezenfekte edin.
2. Hücre durumunu mikroskop altında gözlemleyin. Birleşme seviyesi yaklaşık% 80'dir.
3. Dezenfeksiyondan sonra çanağı ultra temiz masaya aktarın. Süpernatanı bir pipetle dikkatlice toplayın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
   NOT: Hücreler dondurulabilir veya atılabilir. Sterilite gerekli değilse, ameliyat masasında aşağıdaki adımlar gerçekleştirilebilir. Bu noktada, deneme duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabilir. Deney durdurulursa, süpernatanı bir haftadan fazla olmamak üzere 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın. EV'lerin aktivitesini etkileyebileceğinden uzun süreli depolama önerilmez. En uygun yaklaşım, EV'leri hemen çıkarmaktır.
4. Asılı hücreleri çıkarmak için santrifüjleyin (300 x g, 10 dakika, oda sıcaklığında). Süpernatanı bir pipetle toplayın.
   NOT: Dökmeyin. Peletin emilmesini önlemek için biraz süpernatan bırakın.
5. Hücresel kalıntıları (2000 x g, 10 dk, 4 °C) çıkarmak için santrifüjleyin, ardından süpernatanı bir pipetle toplamaya devam edin.
   NOT: Önemli noktalar adım 3.4'teki ile aynıdır.
6. Büyük parçacıkları ve hücre kalıntılarını gidermek için süpernatanı 0.22 um membranla filtreleyin.
   NOT: Filtrasyondan önce filtre membranını nemlendirmek için süpernatanı 2 mL steril PBS ile filtreleyin.
7. Ultrasantrifüj makinesinde santrifüjleyin (10.000 x g, 30 dk, 4 °C).
8. Daha sonra, peleti çıkarmak ve süpernatanı toplamak için 1,00,000 ° C'de 70 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
   NOT: Elde edilen EV'ler, saflıklarını artırmak için birçok kez santrifüjleme ile saflaştırıldı. Pelet çıplak gözle görülemeyebilir. Bu nedenle, pelet toplanmasını önlemek için pipeti nazikçe çalıştırmak ve altta biraz süpernatan bırakmak çok önemlidir.
9. Süpernatanı bir pipetle çıkarın. Peleti PBS ve santrifüj (1,00,000 x g, 70 dk, 4 °C) ile yeniden süspanse edin.
   NOT: Pelet çıplak gözle görülemeyebilir. Bu nedenle, süpernatanı bir pipetle aspire ederken, EV'lerin saflığını en üst düzeye çıkarmak için süpernatanı nazikçe ve iyice çıkarmak çok önemlidir.
10. Süpernatanı çıkarın ve EV peletini elde edin. 1 mL PBS ile tekrar süspanse edin, 1 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve sonraki algılama için 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
    NOT: Pelet çıplak gözle görülemeyebilir. Sonuç olarak, süpernatanı bir pipetle aspire ederken, EV'nin saflığını en üst düzeye çıkarmak için süpernatanı nazikçe ve iyice çıkarmak çok önemlidir. Numunelere uzun süre ihtiyaç duyulmayacaksa, -80 °C'lik bir buzdolabında saklayın.

Sonuçlar

İlk olarak, ADSC'ler, morfolojileri¹⁰ ve yüzey antikorları dahil olmak üzere karakterize edildi ve tanımlandı. Şekil 2A'ya dayanarak, ADSC'lerin bir iğ şeklinde düzenlendiği ve yoğun büyümeden sonra bir girdap oluşturduğu açıktır. Kültürlenen hücreler adipojenik, osteojenik ve kondrojenik hücrelere ayrıldı ve Yağ Kırmızısı O, Alizarin Kırmızısı ve Alcian Mavisi¹¹ ile boyandı. İndüklenmiş farklılaşma deney...

Tartışmalar

Resmi deney süreci sırasında, en iyi deneysel sonuçları elde etmek için birkaç nokta çok önemlidir. Önceki deneyimlerimize dayanarak, mümkün olan en iyi hücre durumunu sağladıkları için geçiş 3-6 ADSC'lerin tercih edilmesi önerilir. P3'ten önce, kırmızı kan hücreleri, endotel hücreleri ve diğer çeşitli hücreler taranmamış olabilir. P6'dan sonra, hücreler yavaş yavaş yaşlanabilir ve bu da salgılanan EV'lerin durumunu etkileyebilir. İkinci olarak, mümkün olduğu kadar çok EV'nin yet...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture	OriCell	BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)	OriCell	HUXMD-05002
Inverted Microscope	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)	Solarbio	P1410