Purificazione e caratterizzazione di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana

Riepilogo

Questo protocollo descrive tutte le procedure, dalla coltura di cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana (ADSC) e la raccolta del surnatante all'estrazione delle vescicole extracellulari (EV) mediante ultracentrifugazione.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana (ADSC) possono promuovere la rigenerazione e la ricostruzione di vari tessuti e organi. Recenti ricerche suggeriscono che la loro funzione rigenerativa può essere attribuita al contatto cellula-cellula e agli effetti paracrini cellulari. L'effetto paracrino è un modo importante per le cellule di interagire e trasferire informazioni su brevi distanze, in cui le vescicole extracellulari (EV) svolgono un ruolo funzionale come trasportatori. Esiste un potenziale significativo per le EV ADSC nella medicina rigenerativa. Diversi studi hanno riportato l'efficacia di questi metodi. Attualmente sono descritti vari metodi per l'estrazione e l'isolamento delle vescicole extracellulari basati su principi quali centrifugazione, precipitazione, dimensione molecolare, affinità e microfluidica. L'ultracentrifugazione è considerata il gold standard per l'isolamento delle vescicole extracellulari. Tuttavia, manca ancora un protocollo meticoloso per evidenziare le precauzioni durante l'ultracentrifugazione. Questo studio presenta la metodologia e le fasi cruciali coinvolte nella coltura dell'ADSC, nella raccolta del surnatante e nell'ultracentrifugazione EV. Tuttavia, anche se l'ultracentrifugazione è conveniente e non richiede ulteriori trattamenti, ci sono ancora alcuni inevitabili inconvenienti, come un basso tasso di recupero e l'aggregazione di EV.

Introduzione

La maggior parte delle ADSC deriva dal tessuto adiposo ed è stato dimostrato che promuove la rigenerazione e la ricostruzione di vari tessuti e organi, tra cui il miocardio, l'osso e la pelle¹. Ricerche recenti suggeriscono che la funzione rigenerativa delle ADSC può essere dovuta al contatto intercellulare e agli effetti paracrini delle cellule². L'effetto paracrino è un mezzo importante per le cellule per interagire e trasferire informazioni su brevi distanze, e questa funzione si ottiene attraverso le vescicole extracellulari (EV).

Le EV sono strutture di membrana a doppio strato prodotte d....

Protocollo

La panoramica dei passaggi del protocollo è illustrata nella Figura 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione dei terreni

1. Preparare un terreno di coltura per ADSC senza esosomi utilizzando 450 ml di terreno di coltura basale, 50 ml di siero fetale bovino senza esosomi e 5 ml di triplo antibiotico.

2. Rianimazione e coltura degli ADSC

NOTA: Rianimare gli ADSC.

1. Accendere preventivamente i raggi ....

Discussione

Durante il processo sperimentale formale, diversi punti sono cruciali per ottenere i migliori risultati sperimentali. Sulla base della nostra esperienza precedente, si consiglia di optare per ADSC di passaggio 3-6, in quanto garantiscono il miglior stato cellulare possibile. Prima della P3, i globuli rossi, le cellule endoteliali e altre cellule varie potrebbero non essere stati sottoposti a screening. Dopo P6, le cellule possono invecchiare gradualmente, il che può influenzare lo stato delle vescicole extracellulari se.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture	OriCell	BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)	OriCell	HUXMD-05002
Inverted Microscope	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)	Solarbio	P1410