Purification et caractérisation de vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain

Résumé

Ce protocole décrit toutes les procédures, de la culture de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ADSC) et de la collecte du surnageant à l’extraction de vésicules extracellulaires (VE) par ultracentrifugation.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ADSC) peuvent favoriser la régénération et la reconstruction de divers tissus et organes. Des recherches récentes suggèrent que leur fonction régénératrice peut être attribuée au contact cellule-cellule et aux effets paracrines cellulaires. L’effet paracrine est un moyen important pour les cellules d’interagir et de transférer des informations sur de courtes distances, dans lesquelles les vésicules extracellulaires (VE) jouent un rôle fonctionnel en tant que transporteurs. Il existe un potentiel important pour les VE ADSC en médecine régénérative. De nombreuses études ont fait état de l’efficacité de ces méthodes. Diverses méthodes d’extraction et d’isolement des VE sont actuellement décrites sur la base de principes tels que la centrifugation, la précipitation, la taille moléculaire, l’affinité et la microfluidique. L’ultracentrifugation est considérée comme l’étalon-or pour l’isolation des VE. Néanmoins, un protocole méticuleux pour mettre en évidence les précautions lors de l’ultracentrifugation est toujours absent. Cette étude présente la méthodologie et les étapes cruciales impliquées dans la culture ADSC, la collecte de surnageants et l’ultracentrifugation des VE. Cependant, même si l’ultracentrifugation est rentable et ne nécessite aucun traitement supplémentaire, il existe tout de même quelques inconvénients inévitables, tels qu’un faible taux de récupération et une agrégation des VE.

Introduction

La plupart des ADSC sont dérivés du tissu adipeux et il a été démontré qu’ils favorisent la régénération et la reconstruction de divers tissus et organes, y compris le myocarde, les os et la peau¹. Des recherches récentes suggèrent que la fonction régénératrice des ADSC pourrait être due au contact intercellulaire et aux effets paracrines des cellules². L’effet paracrine est un moyen important pour les cellules d’interagir et de transférer des informations sur de courtes distances, et cette fonction est assurée par des vésicules extracellulaires (VE).

Les VE sont des structures membranaires à ....

Protocole

La figure 1 présente une vue d’ensemble des étapes du protocole. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des supports

1. Préparez un milieu de culture pour l’ADSC sans exosomes en utilisant 450 ml de milieu de culture basal, 50 ml de sérum fœtal bovin sans exosomes et 5 ml de trithérapie.

2. Réanimation et culture des ADSC

REMARQUE : Réanimez les ADSC.

1. Allumez au préalable le rayonnement UV de la tabl....

Discussion

Au cours du processus expérimental formel, plusieurs points sont cruciaux pour obtenir les meilleurs résultats expérimentaux. Sur la base de notre expérience précédente, il est recommandé d’opter pour les ADSC de passage 3 à 6, car ils assurent le meilleur état cellulaire possible. Avant la P3, les globules rouges, les cellules endothéliales et d’autres cellules diverses n’ont peut-être pas été éliminés. Après P6, les cellules peuvent vieillir progressivement, ce qui peut affecter l’état des VE s.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture	OriCell	BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)	OriCell	HUXMD-05002
Inverted Microscope	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)	Solarbio	P1410