ヒト脂肪由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞の精製とキャラクタリゼーション

要約

このプロトコルは、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC)の培養や上清の収集から、超遠心分離を使用した細胞外小胞(EV)の抽出まで、すべての手順を説明しています。

要約

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC)は、さまざまな組織や臓器の再生と再構築を促進することができます。最近の研究では、それらの再生機能は、細胞間接触と細胞パラクリン効果に起因する可能性があることが示唆されています。パラクリン効果は、細胞が短距離で相互作用し、情報を伝達するための重要な方法であり、細胞外小胞(EV)がキャリアとしての機能的役割を果たします。ADSC EVは、再生医療に大きな可能性を秘めています。これらの方法の有効性については、複数の研究で報告されています。現在、EVを抽出および単離するためのさまざまな方法が、遠心分離、沈殿、分子サイズ、親和性、マイクロ流体工学などの原理に基づいて説明されています。超遠心分離は、EVを分離するためのゴールドスタンダードと見なされています。それにもかかわらず、超遠心分離中の予防措置を強調するための細心の注意を払ったプロトコルはまだ存在しません。この研究では、ADSC培養、上清収集、およびEV超遠心分離に関与する方法論と重要なステップを示します。しかし、超遠心分離は費用対効果が高く、さらなる治療を必要としないにもかかわらず、回収率が低い、EVが凝集するなど、避けられない欠点がいくつかあります。

概要

ほとんどのADSCは脂肪組織に由来し、心筋、骨、皮膚など、さまざまな組織や臓器の再生と再建を促進することが実証されています¹。最近の研究では、ADSCの再生機能は、細胞間接触と細胞のパラクリン効果によるものである可能性が示唆されています²。パラクリン効果は、細胞が短距離で相互作用し、情報を伝達するための重要な手段であり、この機能は細胞外小胞(EV)を介して達成されます。

EVは、細胞が作り出す二重膜構造で、直径は40nmから160nm(平均約100nm)です。それらは、サイトカイン産生、細胞増殖、アポトーシス、代謝など、さまざまな細胞機能に影響を及ぼします^3,4。ADSC EVの機能については、骨再生の促進、口腔粘膜組織の再生、組織移植後の脂肪組織の生存、皮膚創傷修復など、数多くの研究が行われてきた5,6,7,8。ADSC EVの再生医療における大きな可能性は明らかです。上清からEVを抽出し分離するには、遠心分離....

プロトコル

プロトコルの手順の概要を 図 1 に示します。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 培地の準備

1. 450 mLの基礎培地、エクソソームを含まないウシ胎児血清50 mL、および5 mLのトリプル抗生物質を使用して、エクソソームを含まないADSC用の培地を調製します。

2. ADSCの蘇生と培養

注:ADSCを蘇生します。

1. 超清潔なテーブルの紫外線を事前にONにし、30分間消毒してください。
2. あらかじめ37°Cのウォーターバスで培地を予熱してください。
3. 凍結したADSC(P3)のチューブ2本を液体窒素から取り出し、37°Cの水浴で一定温度で完全に解凍するまで攪拌します。
   注意: 汚染を防ぐために、冷凍庫チューブの開口部を水に接触させないでください。
4. 凍結保存チューブを75%アルコールで消毒し、超清潔なテーブルに移します。ピペットを使用して細胞懸濁液を吸引し、15 mLの遠心チューブに入れます。
5. 遠心分離機チューブを低速遠心分離機に入れ、25....

ディスカッション

正式な実験プロセスでは、最良の実験結果を得るためにいくつかのポイントが重要です。私たちの以前の経験に基づいて、可能な限り最高の細胞状態を保証するため、継代3-6 ADSCを選択することをお勧めします。P3より前は、赤血球、内皮細胞、およびその他の雑多な細胞がスクリーニングされていなかった可能性があります。P6以降、細胞は徐々に老化する可能性があり、分泌されたEVの状?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture	OriCell	BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)	OriCell	HUXMD-05002
Inverted Microscope	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)	Solarbio	P1410