Aufreinigung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt alle Verfahren, von der Kultivierung humaner mesenchymaler Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe über die Entnahme von Überständen bis hin zur Extraktion extrazellulärer Vesikel (EVs) mittels Ultrazentrifugation.

Zusammenfassung

Aus humanem Fett gewonnene mesenchymale Stammzellen (ADSCs) können die Regeneration und den Wiederaufbau verschiedener Gewebe und Organe fördern. Neuere Forschungen deuten darauf hin, dass ihre regenerative Funktion auf Zell-Zell-Kontakt und zellparakrine Effekte zurückzuführen ist. Der parakrine Effekt ist eine wichtige Möglichkeit für Zellen, über kurze Strecken zu interagieren und Informationen zu übertragen, wobei extrazelluläre Vesikel (EVs) eine funktionelle Rolle als Träger spielen. In der regenerativen Medizin besteht ein erhebliches Potenzial für ADSC-Elektrofahrzeuge. Mehrere Studien haben über die Wirksamkeit dieser Methoden berichtet. Derzeit werden verschiedene Methoden zur Extraktion und Isolierung von EVs beschrieben, die auf Prinzipien wie Zentrifugation, Fällung, Molekülgröße, Affinität und Mikrofluidik basieren. Die Ultrazentrifugation gilt als Goldstandard für die Isolierung von Elektrofahrzeugen. Dennoch fehlt nach wie vor ein akribisches Protokoll, um Vorsichtsmaßnahmen während der Ultrazentrifugation hervorzuheben. Diese Studie stellt die Methodik und die entscheidenden Schritte der ADSC-Kultur, der Überstandssammlung und der EV-Ultrazentrifugation vor. Doch auch wenn die Ultrazentrifugation kostengünstig ist und keine weitere Behandlung erfordert, gibt es immer noch einige unvermeidliche Nachteile, wie z. B. eine niedrige Wiederfindungsrate und EV-Aggregation.

Einleitung

Die meisten ADSCs werden aus Fettgewebe gewonnen und fördern nachweislich die Regeneration und den Wiederaufbau verschiedener Gewebe und Organe, einschließlich des Myokards, des Knochens und der Haut¹. Neuere Forschungen deuten darauf hin, dass die regenerative Funktion von ADSCs auf den interzellulären Kontakt und die parakrine Wirkung der Zellen zurückzuführen sein könnte². Die parakrine Wirkung ist ein wichtiges Mittel für Zellen, um zu interagieren und Informationen über kurze Distanzen zu übertragen, und diese Funktion wird durch extrazelluläre Vesikel (EVs) erreicht.

EVs sind von Zellen ....

Protokoll

Die Übersicht über die Protokollschritte ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Medien

1. Bereiten Sie ein Nährmedium für ADSC ohne Exosomen vor, indem Sie 450 ml Basalkulturmedium, 50 ml fötales Rinderserum ohne Exosomen und 5 ml Dreifachantibiotika verwenden.

2. Wiederbelebung und Kultivierung von ADSCs

HINWEIS: Reanimieren Sie ADSCs.

1. Schalten Sie vorher die....

Diskussion

Während des formalen Versuchsprozesses sind mehrere Punkte entscheidend, um die besten experimentellen Ergebnisse zu erzielen. Aufgrund unserer bisherigen Erfahrungen wird empfohlen, sich für die Passage 3-6 ADSCs zu entscheiden, da diese den bestmöglichen Zellzustand gewährleisten. Vor P3 wurden rote Blutkörperchen, Endothelzellen und andere verschiedene Zellen möglicherweise nicht ausgesiebt. Nach P6 können die Zellen allmählich altern, was den Zustand der sezernierten EVs beeinflussen kann. Zweitens muss der ?.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture	OriCell	BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)	OriCell	HUXMD-05002
Inverted Microscope	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)	Solarbio	P1410